Использование в естественных условиях и тканей и клеток экспланта подходы к изучению морфогенеза и патогенез эмбриональных и перинатальной аорты

Общей целью этих процедур является изучение формирования стенок эмбриональной и перинатальной аорты во время нормального развития, а также нарушений в этом процессе во время заболевания. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области развития сосудов, такие как источник клеток, которые вносят свой вклад в эмбриональную и перинатальную сосудистую среду. Основное преимущество этих методик заключается в том, что они позволяют оценить патогенез и морфогенез гладкой мускулатуры, происходящие на эмбриональной и перинатальной стадиях развития.

Применение этих методов связано с лечением сосудистых заболеваний, таких как надклапанный аортальный стеноз периодического заболевания, которое вызывает чрезмерное производство клеток сумо. Процедура установки мини-насоса будет проводиться доктором Цзяшэном Чжаном, научным сотрудником, руководящим микрохирургическим центром и Йельским университетом. Начните с создания брачных пар между двух-шестимесячными мышами с Cre ER и мышами с Cre ER.

С помощью металлического зонда проверяйте наличие вагинальных пробок каждое утро, отделяя самку от самца при обнаружении пробки. Для ранней эмбриональной индукции введите тамоксифен внутрибрюшинно беременной женщине. Чтобы пометить клетки в середине и конце гестационного периода и проследить их судьбу или клональность у постнатальной мыши, введите прогестерон во внутрибрюшинную полость беременной некомпетентно с тамоксифеном в соотношении один к двум дозам.

Чтобы собрать эмбрионы в подходящий эмбриональный срок, очистите брюшную полость беременной влажной с помощью 70% этанола и с помощью ножниц откройте брюшную полость, чтобы удалить матку. Соберите эмбрионы из матки с помощью щипцов и стереомикроскопа, чтобы аккуратно отделить их от плаценты и желточного мешка. Зафиксируйте эмбрионы в 4% параформальдегиде при четырех градусах Цельсия на два часа.

Затем следует три промывки в PBS для удаления излишков фиксатора. После третьей промывки инкубируйте эмбрионы в 30%-ной сахарозе в PBS, в отдельных 15-миллилитровых пробирках до тех пор, пока эмбрионы не опустятся. Затем заполните пластиковые формы для заморозки составом с оптимальной температурой резки до двух третей от максимального объема и поместите по одному зародышу вертикально в каждую форму.

Через 10 минут при комнатной температуре заморозьте ткани в вертикальном положении в ванне с сухим льдом из 70% этанола и установите температуру криостата на 22 градуса Цельсия. Разрезы тканевых блоков для создания поперечных срезов ткани толщиной от 10 до 20 микрометров по всей длине каждой аорты, захватывая каждый срез на предметное стекло микроскопа по мере их получения. Когда все образцы будут собраны, высушите предметные стекла при комнатной температуре в течение 30 минут перед хранением при температуре 80 градусов Цельсия.

Чтобы испачкать образцы ткани, разморозьте предметные стекла при комнатной температуре, защитите их от света во избежание отбеливания флуорофором и промойте предметные стекла в дозе 0,1% PBS twin 20. Для клонального анализа окрашивают ткани соответствующим ядерным красителем и непосредственно визуализируют другие фторофоры репортера радужной краи на флуоресцентном микроскопе. Для картирования судьбы с помощью репортера mTmG cre визуализируйте экспрессию GFP с помощью прямой визуализации с иммуноокрашиванием или без него.

Чтобы культивировать и эксплантировать эмбриональную аорту, поместите эмбрион в положение лежа на спине и закрепите вытянутые конечности на доске для вскрытия под стереомикроскопом. С помощью ножниц сделайте вертикальный разрез от живота через грудину к верхней части грудной клетки. Препарируйте тончайшую трахею легких, пищевода, печени и кишечника.

С помощью щипцов осторожно потяните сердце вентрально, а ножницами рассеките аорту от дорсальной стороны грудной и брюшной полостей. Разрежьте аорту в проксимальном отделе корня и дистальном отделе брюшной полости, чтобы освободить ее, и поместите собранную аорту в стерильный ледяной PBS в капюшон для клеточных культур. После краткого промывания перенесите аорту в одну лунку 24-луночного планшета, содержащего среду DMEM с добавлением 0,5% PBS, и поместите планшет в инкубатор для клеточных культур на срок до 24 часов.

По окончании инкубации дважды промойте аорту PBS и зафиксируйте ткань в 4%-ном параформальдегиде на 20 минут. После еще трех промываний PBS перенесите аорту в 1,5-миллилитровую трубку, содержащую 30% сукрозина PBS, до тех пор, пока ткань не опустится. Для выделения гладкомышечных клеток перинатальной аорты используйте иглу 23 калибра для прокола левого желудочка мыши на 0,5-й день после рождения и используйте пластиковую трубку для подключения иглы к стерильному шприцу, содержащему PBS, удерживаемому вертикально в приподнятом положении, чтобы PBS поступал в левый желудочек под действием силы тяжести.

Когда печень побледнеет, используйте щипцы для удаления адвентициальной ткани с внешней стороны аорты и забора аорты, как показано выше. Диссоциировать ткань аорты в 500 микролитрах раствора для пищеварения с ручным встряхиванием каждые пять-10 минут. Через 45 минут перенесите пробирку в стерильный колпак для клеточных культур и с помощью пипетки объемом 200 микролитров растирайте тканевую суспензию до получения одноклеточной суспензии.

Переложите клетки в коническую пробирку объемом 15 миллилитров, а затем добавьте два миллилитра DMEM и соберите клетки путем центрифугирования. Повторно суспендируйте гранулу в трех миллилитрах среды для культивирования гладкомышечных клеток и засейте клетки на 35-миллиметровую культуральную пластину. Затем поместите планшет в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия, обновляя среду для клеточных культур каждые три дня.

Чтобы установить подкожную осмотическую мини-помпу, начните с бритья нижней части спины мыши, находящейся под наркозом, машинками для стрижки и поместите мышь в положение лежа на нагретую хирургическую пластину. Потрите заднюю часть бетадином и изопропиловым спиртом и поместите мышь под стереомикроскоп. Затем с помощью скальпеля сделайте горизонтальный разрез кожи от 0,5 до одного сантиметра примерно на три-пять сантиметров рострально от основания хвоста, не травмируя подлежащую мышцу.

Вставьте гемостат в разрез и откройте и смыкайте губки гемостата, чтобы создать подкожный карман. Вставьте в карман осмотическую мини-помпу, наполненную интересующим веществом, и наложите 6 нерассасывающихся швов на разрез. Затем дайте мышке восстановиться с контролем до достижения лежачего состояния грудины.

Эмбрионы, мутирующие по гену, кодирующему белок внеклеточного матрикса, эластин, накапливают избыток гладкомышечных клеток во внутренних слоях аорты, начиная с 15,5-го дня эмбриона. Клональный анализ гладкомышечных клеток с помощью многоцветного репортера cre во время этого процесса показывает, что клетки имеют несколько цветов и, таким образом, являются поликлональными. Иммуноокрашивание эксплантированных срезов аорты показывает, что эластин мутантный эмбриональный аорты на 15,5-й день становится гипермускулистыми и стенодными в течение 18 часов после культивирования, и этот процесс ослабляется добавлением антиантегрина бета-3 блокирующего антитела.

Гладкомышечные клетки, выделенные из аорты мышей дикого типа, которые после 0,5-го дня рождения экспрессируют маркеры гладкомышечных клеток, но не экспрессируют CD31. Непрерывная инфузия ингибитора бета-3 ингибитора интегрина во влажные фазы беременных, начиная с 13,5-го дня эмбрионального периода, значительно ослабляет аортальный стеноз и гипермускуляризацию у мышей, мутантов на белок внеклеточного матрикса эластин. Но не стоит переделывать аорты у мышей дикого типа.

После освоения техники установки осмотического мини-насоса можно выполнить менее чем за 10 минут, если она выполнена правильно. После этих процедур эти подходы также могут быть экстраполированы для изучения гладкой мускулатуры, кодируемой, неваскулярной, такой как ткань желудочно-кишечного тракта или области легких. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как проводить in-vivo картирование эмбриональной посадки и клональный анализ, культивировать эксплантированные эмбриональные аорты, перинатальные гладкомышечные клетки аорты и эксплантировать подкожные осмотические мини-насосы.

Не забывайте, что работа с мышами, тамоксифеном и стационарным редуктором может быть опасной, и что при выполнении этих процедур всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение перчаток и лабораторного халата, а также проявление особой осторожности.