Нанотрубках ДНК как универсальный инструмент для изучения полугибких полимеров
25 октября 2017 г.
Полугибких полимеров отображения уникальные механические свойства, которые широко применяются в живущих систем. Однако систематические исследования биополимеров ограничены, поскольку такие свойства, как жесткость полимера недоступны. Эта рукопись описывает, как обойти это ограничение, программируемые ДНК нанотрубок, позволяя экспериментальные исследования о влиянии накаливания жесткости.
Общая цель этой новой модельной системы, основанной на ДНК, состоит в том, чтобы понять фундаментальные свойства класса полугибких полимеров, которые также описывают поведение жизненно важного класса биополимеров. Этот новый метод позволяет исследовать ключевые вопросы в области мягкой метафизики, в частности, он позволяет исследовать поведение полугибких филаментов и их расположение в сети. Основное преимущество этой методики заключается в том, что механические свойства интравивных нитей доступны экспериментально и могут быть точно настроены.
Полугибкие полимеры характеризуются особыми свойствами нитей, которые ранее рассматривались только в теоретической основе из-за отсутствия настраиваемых экспериментальных систем. Хотя этот метод дает представление об определении количества полугибких полимеров, он также может быть применен в качестве нового гидрогеля для изучения миграции клеток в матрицах различной жесткости без изменения размера ячеек под закладкой. Самую маленькую повторяющуюся единицу в нанотрубке можно рассматривать как единичное кольцо.
Некоторые из этих единичных колец складываются во время гибридизации. Это приводит к образованию удлиненных нанотрубок. Для начала повторно суспендируйте лиофилизированные олигонуклеотиды в очищенной воде и следуйте дальнейшим шагам ресуспендирования, приведенным в соответствующей инструкции от компании.
Отрегулируйте количество воды так, чтобы конечная концентрация составила 200 микромоляров. Определите концентрацию отдельных нитей ДНК, чтобы проверить значения, предоставленные дистрибьютором, поскольку точная стехиометрия имеет решающее значение для процесса сборки. С помощью микропипетки смешайте нити ДНК одинаковой концентрации в контейнере, подходящем для термоамплификатора, чтобы сформировать желаемую ДНК и спиральные трубки.
Гибридизуйте ДНК и спиральные трубки в термоамплификаторе с использованием параметров, найденных в текстовом протоколе. Храните гибридизированные ДНК и спиральные трубки до 3 недель при температуре 4 градуса Цельсия без заметной деградации. Перед проведением реологии тщательно разбавьте образец до нужной конечной концентрации, используя при необходимости буфер для пробы.
Выберите подходящую геометрию для динамического реометра сдвига. Затем загрузите образец на реометр. Чтобы предотвратить потенциальный эффект испарения, пассивируйте воздушно-водную границу раздела образца и окружающей среды с помощью 1 из 3 методов.
Либо окружите образец 2,5 миллилитрами буферной ванны для образца. Или добавьте в образец поверхностно-активное вещество чуть ниже концентрации мицелл. В качестве альтернативы используйте шприц Гамильтона, чтобы окружить образец липидами, чтобы избежать прямого контакта образца с воздухом.
Запечатайте камеру для образцов с помощью колпачка, оснащенного влажными губками. И, по возможности, использовать дополнительную водяную баню для дальнейшего подавления испарения. Начните измерение с помощью специального программного обеспечения реометра при комнатной температуре, позволяя образцу балансироваться в течение 2 часов при комнатной температуре.
Время уравновешивания имеет решающее значение для того, чтобы система термофлекса перешла в полное изотропное рандомизированное состояние, поскольку это единственное подтверждение, позволяющее сравнивать различные измерения. После измерения обработайте данные так, как описано в текстовом протоколе. Приготовьте 8 аликвот по 12 микролитров для каждого образца, используя от 1 до 4 микромолярных ДНК на нить, 12,5 миллимоляров хлорида магния и 1x гель для нуклеиновых кислот.
Кроме того, сделайте отрицательный контроль без ДНК, но включите в него гель-краситель с нуклеиновой кислотой. Перенесите аликвоты на планшет для ПЦР в реальном времени и запечатайте клейкой пленкой. Центрифугируйте планшет при 100-кратном G в течение 1 минуты при комнатной температуре, чтобы удалить пузырьки газа.
Очень важно удалять пузырьки газа, потому что они могут расширяться во время измерений, и образцы не могут быть проанализированы. После центрифугирования загрузите герметичную пластину в систему количественной ПЦР в режиме реального времени. Запрограммируйте программу отжига так, чтобы денатурировать ДНК при температуре девяносто градусов Цельсия в течение 10 минут и быстро снизить температуру до семидесяти двух градусов Цельсия.
Затем температура должна медленно снижаться на 0,5 градуса тепла каждые тридцать минут. После того как сигнал затухнет, разгоните температурный нарастание. Следите за тем, чтобы крышка амплификатора нагревалась не менее чем до ста градусов по Цельсию, чтобы предотвратить конденсацию испарившегося образца на клейкой пленке.
Во время сборки возбуждайте образцы с помощью аргонового ионного лазера на четыреста восемьдесят восемь нанометров и обнаруживайте флуоресценцию на глубине 550 нанометров при использовании красителя CY3. Для других красителей выберите подходящую комбинацию излучения возбуждения. Измеряйте сигнал флуоресценции как можно чаще, чтобы повысить общее качество сигнала с помощью встроенной камеры.
Приведены репрезентативные исходные данные реологических измерений, показывающие эластичность сети. Здесь показан развертка по времени во время равновесия. Этот график показывает деформационно-зависимое поведение сети.
На этом графике очевидно частотно-зависимое поведение сети. На этом этапе выбираются значения с определенной частотой. Значения для конкретной популяции спиральной трубки ДНК были построены в зависимости от концентрации.
Этот процесс повторялся для всех ДНК и спиральных трубок. Затем уклон был извлечен на участке с бревенчатым бревентом, что дало степенной показатель закона. Наконец, значения были перестроены в зависимости от стойкой длины для каждой измеренной концентрации.
Эти графики позволяют извлечь масштабирование модуля упругого плато по отношению к концентрации и длине персистенции. После разработки этот метод проложил путь исследователям в области мягкой материи и физики полимеров к изучению влияния жесткости нити для класса полугибких полимеров. Следуя этой процедуре, можно устранить дополнительные эффекты, такие как повторение запутанных сетей, скрещивание сетей в целом и процесс формирования структуры.
После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как гибридизировать нанотрубки ДНК и как измерить реологические свойства их сетей.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлена модельная система на основе ДНК для изучения полугибких полимеров, которые имеют решающее значение для понимания поведения биополимеров. Этот метод обеспечивает экспериментальный доступ к механическим свойствам таких полимеров, позволяя получить данные об их жесткости и организации в сетевые структуры.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биополимеры
- Физика мягкого вещества
- Механические свойства полимеров
Теоретические основы
- Полужесткие полимеры обладают уникальными механическими свойствами.
- Предыдущие исследования этих полимеров носили преимущественно теоретический характер.
- Понимание их жесткости имеет важное значение для различных биологических приложений.
- Программируемые нанотрубки из ДНК обеспечивают новый экспериментальный подход.
Цель исследования
- Изучить поведение полугибких филаментов.
- Исследовать их организацию в сети.
- Создать регулируемую экспериментальную систему для изучения механических свойств.
Используемые методы
- Разработка программируемых ДНК-нанотрубок.
- Экспериментальная настройка жесткости филаментов.
- Применение системы для изучения миграции клеток в гидрогелях.
- Анализ механических свойств в связи с формированием сети.
Основные результаты
- ДНК-нанотрубки позволяют точно контролировать жесткость филаментов.
- Были получены данные о механических свойствах полугибких полимеров.
- Данный метод может быть применен для изучения поведения клеток в матрицах с различной степенью жесткости.
- Экспериментальные результаты подтверждают теоретические прогнозы относительно поведения полимеров.
Выводы
- Данное исследование предлагает новую концептуальную основу для понимания полугибких полимеров.
- Программируемые ДНК-нанотрубки являются ценным инструментом для экспериментальной биологии.
- Будущие исследования могут использовать данный метод для более широкого применения в биофизике.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Программируемые ДНК-нанотрубки представляют собой настраиваемую экспериментальную систему для изучения полугибких полимеров, что позволяет устранить ключевое ограничение в моделировании механики биополимеров. Это способствует снижению механистических рисков при валидации мишеней путем установления связи между жесткостью нитей и поведением сети в условиях, соответствующих клеточному окружению. Данный подход повышает прогностическую достоверность доклинических моделей взаимодействий с внеклеточным матриксом и систем доставки лекарств на основе гидрогелей.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичное обнаружение и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать, как персистентная длина влияет на механику филаментов и формирование сетей.
- Практическая ценность: обеспечивает стабильную, настраиваемую систему на протяжении нескольких недель, что снижает вариабельность при тестировании гипотез на ранних этапах.
- Научная ценность: способствует функциональной валидации мишеней путем моделирования полугибких биополимеров, таких как актин, в контролируемом формате.
Скрининг и разработка методов анализа
- Научная ценность: позволяет получать количественные реологические показатели (модуль упругого плато), коррелирующие с длиной персистенции и концентрацией.
- Практическая ценность: обеспечивает стандартизированное приготовление филаментов микронной длины с воспроизводимой кинетикой полимеризации.
- Научная ценность: способствует разработке методов анализа для скрининга соединений, изменяющих механику сетей полужестких полимеров.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Моделирует механику внеклеточного матрикса для изучения миграции клеток в гидрогелях с регулируемой жесткостью без изменения размера пор.
- Практическая ценность: Обеспечивает возможность длительного хранения (до 3 недель при 4°C) без деградации, что позволяет проводить многодневные доклинические анализы.
- Научная ценность: Связывает измерения персистентной длины одиночных молекул с механикой сети в макромасштабе для обеспечения трансляционной непрерывности.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум открытий — от валидации мишени до доклинической оценки — предоставляя настраиваемую платформу для анализа того, как жесткость филаментов влияет на биологические результаты в анализах, зависящих от матрикса.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез о поведении полугибких полимеров за счет точной экспериментальной настройки жесткости.
- Скрининг: предоставляет количественные, воспроизводимые реологические данные, позволяющие проводить надежный скрининг соединений в гидрогелевых матрицах.
- Аналитика: позволяет определять показатели степенного закона и масштабируемые зависимости между модулем упругости, концентрацией и длиной персистенции для проведения сравнительного анализа данных.
- Трансляционные исследования: устанавливает связь между жесткостью на молекулярном уровне и механикой сети, что имеет значение для тканевой инженерии и исследований миграции клеток.
- Корпоративное повторное использование: создает универсальную платформу для изучения механики полугибких полимеров в рамках нескольких проектов по биофизике и биоматериалам.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность в исследованиях полугибких полимеров, предоставляя настраиваемую стабильную модельную систему.
- Практическая ценность: Обеспечивает воспроизводимость за счет стандартизированных протоколов гибридизации, разведения и реометрии.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о целесообразности дальнейшей разработки биоматериалов, позволяя предсказывать механику сети на основе параметров молекулярного дизайна.
- Влияние на портфель разработок: Обеспечивает обоснованный с учетом рисков прогресс в создании составов гидрогелей на основе валидированных взаимосвязей «структура — свойство».
Особенности реализации
- Требуются навыки в области гибридизации ДНК, реометрии и количественного анализа на основе флуоресценции.
- Необходим доступ к термоциклеру, динамическому сдвиговому реометру и системе ПЦР в реальном времени для сборки и валидации.
- Требуется стандартизация концентраций олигонуклеотидов и условий по хлориду магния между исследовательскими группами.
- Необходимо учитывать особенности адаптации при переносе механики нанотрубок на системы природных биополимеров или гидрогелей.
- Существуют практические ограничения, такие как необходимость предотвращения испарения во время реометрии и удаления пузырьков газа перед анализом методом qPCR.
