Определение содержания гликогена в цианобактериях

Здесь мы представляем надежный и простой анализ для измерения содержания гликогена в клетках цианобактерий. Процедура влечет за собой осаждение, селективную деполимеризацию и обнаружение остатков глюкозы. Этот метод подходит как для дикого типа, так и для генетически модифицированных штаммов и может способствовать метаболической инженерии цианобактерий.

Общая цель этой процедуры заключается в определении содержания гликогена в цианобактериях с помощью селективного гидролиза и анализа на основе ферментов. Этот метод может помочь ответить на ключевой вопрос в области цианобактерий, таких как физиология, молекулярная генетика и биоинженерия различных исследуемых штаммов цианобактерий. Основное преимущество этой техники заключается в том, что она адаптирована к небольшим масштабам, проста в выполнении, очень чувствительна и специфична для гликогена.

Хотя этот метод может дать представление о цианобактериях, он также может быть применен к другим микроорганизмам, которые накапливают гликоген или крахмал, таким как кишечная палочка, дрожжи, микроводоросли и различные гетеротрофные и фототрофные микроорганизмы. Начните этот протокол с подготовки культур цианобактерий, как описано в текстовом протоколе. Переложите один миллилитр культуры цианобактерий или клеточной суспензии в пробирку объемом 1,5 миллилитров.

Затем центрифугируйте при 6 000 умноженных на g и четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Выбросьте надосадочную жидкость перед повторной суспендированием гранулы в одном миллилитре 50 миллимоляров Tris-HCL pH 8. Центрифугируйте ресуспендированную гранулу, как и раньше.

Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в буфере Tris-HCL. Центрифугируйте пробирки, как и раньше, и выбросьте надосадочную жидкость. Затем тщательно суспендируйте гранулу в 500 микролитрах 50 миллимолярного буфера Tris-HCL pH восемь.

Очень важно, чтобы гранула была хорошо подвешена для эффективного лизиса. Храните ресуспензию в льду. Лизируйте ресуспендированные клетки при температуре 4 градуса Цельсия с помощью 30 циклов ультразвука, каждый из которых состоит из 30 секунд с частотой 20 килогерц с максимальной амплитудой, а затем 90 секунд без него.

Центрифугируйте пробирку, содержащую лизат, при температуре 6 000 g и четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. После центрифугирования в грануле должны быть в основном крупные клеточные остатки, а для дальнейшего анализа используется надосадочная жидкость. На этом этапе определите концентрацию белка с помощью набора для анализа белка.

Удалите хлорофилл а из клеточного лизата, смешав 900 микролитров этанола и 100 микролитров полученного надосадочной жидкости в пробирке с завинчивающейся крышкой объемом 1,5 миллитра. Закрыв крышку, нагрейте трубку при температуре 90 градусов Цельсия в течение 10 минут, используя стандартный лабораторный нагревательный блок. Затем инкубируйте трубку во льду в течение 30 минут.

Затем центрифугируйте пробирку при 20 000 умноженных на g и четырех градусах Цельсия в течение 30 минут. После центрифугирования осторожно удалите надосадочную жидкость. В грануле содержится гликоген.

Слегка подсушите гранулу на воздухе, чтобы удалить излишки этанола. Не пересушивайте гранулу чрезмерно, чтобы избежать ее сложного растворения. Измерьте поглощение на 666 нанометрах полученной надосадочной жидкости, чтобы определить содержание хлорофилла а.

Значение может быть использовано для нормализации содержания гликогена. Растворите в грануле 100 микролитров 50 миллимолярного ацетата натрия pH пять. Хорошо перемешайте эти материалы, используя вихрь.

Смешивание с помощью пипетки не рекомендуется, поскольку смесь вязкая. Также добавьте 50 микролитров восьми единиц на миллилитр амилоглюкозидазы и 50 микролитров двух единиц на миллилитр альфа-амилазы. Затем инкубируйте смесь при температуре 60 градусов Цельсия в нагревательном блоке в течение двух часов, чтобы обеспечить переваривание гликогена в молекулы глюкозы.

После инкубации центрифугируйте образец при 20 000 g в течение пяти минут и переложите надосадочную жидкость в новую пробирку объемом 1,5 миллилитров. Измерьте концентрацию глюкозы в надосадочной жидкости после ферментативного гидролиза с помощью реагента GOD-POD. Перенесите 100 микролитров надосадочной жидкости со стадии осаждения гликогена в лунку в 96-луночной пластине.

В качестве отрицательного контроля используйте 100 микролитров 50 миллимолярного ацетата натрия pH пять. Для построения калибровочной кривой также измерьте стандартные растворы глюкозы. Добавьте по 150 микролитров реагента GOD-POD в каждый образец и быстро перемешайте с помощью пипетирования.

Выдерживайте тарелку при температуре 25 градусов Цельсия в течение 30 минут. Затем запишите значение поглощения на 510 нанометров с помощью считывателя пластин. Рассчитайте количество гликогена в эквиваленте глюкозы, используя калибровочную кривую, полученную из стандартов глюкозы.

Здесь показано содержание гликогена в synechocystis. Два мутантных штамма, дельта pmg A и дельта pmg R, которые, как известно, гипераккумулируют гликоген, сравнивались со штаммом дикого типа. Как и ожидалось, мутантные штаммы показали повышенный уровень гликогена.

И наоборот, мутант, у которого отсутствует гликогенсинтаза, не накапливал гликоген. Используемые здесь штаммы были спроектированы для производства маннитола. Примечательно, что мутант гликогенсинтазы продуцировал больше маннитола, чем контрольный штамм, что говорит о том, что синтезируемый в процессе фотосинтеза углевод перенаправляется на маннит в мутантном штамме, не способном синтезировать гликоген.

После просмотра этого видео вы сможете количественно определить содержание гликогена в цианобактериях уже через пять часов. При выполнении этой процедуры важно помнить о тщательной ресуспензии клеток и солюбилизации гранул гликогена для получения надежных результатов. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как анализ активности метаболических ферментов, с использованием оставшихся лизатов клеток, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, как регулируется углеводный обмен у цианобактерий.