Высокопроизводительного скрининга для наследования на основе белков в S. cerevisiae

Общая цель этого высокопроизводительного фенотипирования дрожжей заключается в скрининге белков, которые нарушают длительную фенотипическую память о пропущенной экспрессии, в качестве прокси для наследования на основе белка. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области дрожжей Прион, такие как, сколько белков может быть незаконно наследование этого типа. Основное преимущество этого метода заключается в том, что вы можете непредвзято проверять многие белки и пути.

Начните эту процедуру с выращивания соответствующих дрожжевых клеток в 96-луночном планшете при температуре 30 градусов Цельсия, как описано в текстовом протоколе. Визуально осмотрите культуры, чтобы убедиться, что культуры насыщены, клетки должны быть видны на глаз, на дне каждой лунки. Используйте робота для работы с жидкостями для подготовки 384 луночных планшетов, содержащих 45 микролитров соответствующей среды на лунку.

Сначала нанесите Scal-URA в лунки 384-луночной пластины. Затем дозируйте Scal-URA плюс интересующий вас стрессор в лунки второй пластины, в качестве стрессора в этом эксперименте используется 20 миллимоляров хлорида марганца. В-третьих, диспенсируйте SD-URA, который не будет индуцировать экспрессию плазмид, плюс хлорид марганца в другую пластину.

Опустите 96-луночную пластину, содержащую культуры, на робота для работы с жидкостями и инокулируйте от одного до четырех массивов по одному микролитру из каждой лунки 96-луночной пластины в четыре отдельные лунки каждой 384-луночной пластины, заполненные различными средами. Сразу же поместите пластины с ячейками на укладчик микропланшетов при комнатной температуре и атмосферном углекислом газе. Настройте протокол для 72-часового непрерывного цикла, измеряя оптическую плотность на расстоянии 600 нанометров с помощью считывателя микропланшетов.

После измерений роста перенесите один микролитр на лунку индуцированных культурой SCal-URA, в которых наблюдалась гиперэкспрессия белка, в новые 384-луночные планшеты, содержащие 45 микролитров на лунку среды ST-URA, которая не допускает экспрессии белка плазмиды. Параллельно проводят аналогичную инокуляцию второго набора 384-луночных планшетов, содержащих 45 микролитров на лунку ST-URA, из культур, которые были выращены в ST-URA в присутствии стрессора. Поместите пластины во увлажненную камеру и выращивайте пластины в течение 48 часов при температуре 30 градусов Цельсия до насыщения.

Через 48 часов используйте планшеты для повторной инокуляции одного микролитра на лунку в 384 луночных планшетах, содержащих 45 микролитров на лунку ST-URA. Затем выполните отдельную повторную инокуляцию одного микролитра на лунку с той же исходной пластины в отдельную 384-луночную пластину, содержащую 45 микролитров ST-URA на лунку со стрессором. Немедленно поместите планшеты с ячейками микроукладчика при комнатной температуре и атмосферном углекислом газе и установите протокол на 48-часовой непрерывный цикл, измеряя оптическую плотность на 600 нанометрах с помощью считывателя микропланшетов.

Когда измерения роста будут завершены, используйте программное обеспечение для чтения пластин, чтобы экспортировать зависимость времени от оптической плотности при измерениях 600 нанометров в виде таблицы XY. Сгруппируйте столбцы измерений оптической плотности для каждого биологического реплицита вместе и вычислите среднее значение. Создание графика зависимости времени XY от оптической плотности на длине волны 600 нанометров для построения кривых роста.

Для культур, которые выбрали значительные различия в росте в ответ на данный стрессор, зависящие от сверхэкспрессии предкового белка, возьмите один микролитр из каждой биологической реплики, разведите в 10 миллилитрах воды, а затем нанесите 50 микролитров на планшеты, содержащие 5-FOA. Выращивайте при температуре 30 градусов Цельсия в течение трех дней. Если это приводит к слишком большому или слишком малому количеству колоний на пластине, соответствующим образом отрегулируйте коэффициент разведения.

Идеальным вариантом является от 100 до 200 колоний на тарелке. Выберите от 8 до 32 одиночных колоний с помощью автоклавных зубочисток и прикрепите их к 96 луночным планшетам, содержащим 150 микролитров SDCSM на лунку. Поместите пластины во увлажненную камеру и выращивайте до насыщения в течение 48-72 часов при температуре 30 градусов по Цельсию.

Используйте эти культуры для инокуляции двух новых наборов 96-луночных планшетов, содержащих 150 микролитров SDCSM на лунку, как со стрессором, так и без него. Поместите пластины на укладчик микропланшетов и установите протокол для измерения оптической плотности на уровне 600 нанометров в 48-часовом непрерывном цикле. Через 48 часов проанализируйте данные, как показано ранее, и подтвердите, что значительные различия в росте, наблюдавшиеся ранее, сохраняются после потери плазмид.

Клетки, которые поддерживают индуцированные фенотипы, затем проверяются на классические признаки наследования на основе белка, как описано в текстовом протоколе. Этот скрининг наследования на основе белка выявил временную сверхэкспрессию открытой рамки считывания PSP1, что приводит к резистентности к хлориду марганца, которая сохранялась в клетках в течение сотен поколений долгое время после того, как сверхэкспрессия прекратилась. Алгоритмы прогнозирования прионов оценили конечный конец PSP1 как умеренно прионный.

В отличие от этого, алгоритмы практически не предсказывали существенных прионоподобных особенностей последовательности от большинства индуцирующих белков, восстановленных на экране, как показал этот репрезентативный анализ. Измерения роста штаммов и SDCSM с хлоридом марганца, нормализованные до соответствующего наивного PSP1 минус контроль, показали, что ингибирование дезагрегаза HSP104 не ухудшает PSP1-зависимую резистентность к хлориду марганца, в то время как удаление шаперона HSP70 и гена PSP1 наследственно устраняет этот фенотип. Все споры из одиночных тетрад скрещивания между штаммами, несущими PSP1-зависимое фенотипическое состояние и наивные штаммы, демонстрируют устойчивость к хлориду марганца, что указывает на неменделевское наследование фенотипа.

Сравнение инфекционности для трансформации белка между фиктивными лизатами и PSP1, содержащими лизаты в качестве трансмиссивного материала, показало, что более 53% наивных клеток, трансформированных с посевом PSP1, получили соответствующий фенотип устойчивости к хлориду марганца. После освоения этой техники ее можно выполнить за пару недель, включая этапы инкубации и подготовку большинства этапов скрининга менее чем за два часа в день, даже при большом количестве планшетов. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что именно вы хотите протестировать, заранее и помнить о масштабе эксперимента.

Сейчас это особенно важно для новичков в технике. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, подобные описанным в текстовом протоколе, чтобы определить, демонстрируют ли фенотипы, наблюдаемые при скрининге, истинный, прионный паттерн наследования. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области эпигенетики к изучению широты биологии прионов в крестцовой службе CI.После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как разработать высокопроизводительный скрининг для новых форм наследования на основе белка у дрожжей, как непредвзятым, так и целенаправленным образом.

Не забывайте, что некоторые химические стрессоры, такие как повреждающие ДНК агенты, могут быть чрезвычайно опасными, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение средств индивидуальной защиты.