Потянув нанотрубок мембраны из гигантских однослойных везикул
7 декабря 2017 г.
Многие белки в ячейке смысла и побудить мембраны кривизны. Мы описываем метод тянуть нанотрубок мембраны из липидов пузырьки для изучения взаимодействия белков или любой кривизны активные молекулы с изогнутой мембраны в пробирке.
Общая цель этой методологии вытягивания нанотрубок заключается в количественном изучении взаимодействий между конкретными белками, представляющими интерес, и сильно изогнутыми мембранами. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы биологии клеточных мембран, такие как эндоцитоз и внутриклеточный транспорт. Этот метод позволяет нам напрямую количественно оценить, как белки связываются с изогнутыми мембранами и взаимно деформируют их.
Первоначально этот метод использовался для измерения основных механических свойств липидных мембран. В последнее время он был применен для выяснения важных механизмов взаимодействия белковых мембран, в частности мембран, формирующих белок. Начните со сбора гигантских однослойных пузырьков непосредственно из платиновых проволок камеры электроформования.
Чтобы построить экспериментальную камеру, поместите две прямоугольные стеклянные крышки на расстоянии одного миллиметра друг от друга на металлическое основание, оставив отверстия вдоль длинных краев достаточно большими, чтобы стеклянный наконечник микропипетки мог достать, по крайней мере, до центра камеры. Наполните экспериментальную камеру и стеклянную микропипетку пятью миллиграммами на миллилитр высокочистого раствора бета-казеина, стараясь не допустить образования пузырьков. Во время пассивации камеры установите ее на световой микроскоп с центром над объективом и вставьте наконечник аспирационной микропипетки через отверстие по длинному краю, пока кончик не окажется над объективом.
Отрегулируйте уровень в резервуаре для воды так, чтобы давление аспирации было близко к нулю, и заполните микропипетку для инъекций интересующей молекулой, растворенной в экспериментальном буфере в соответствующей экспериментальной концентрации. Установите микропипетку для инъекций внутрь микроманипулятора и вставьте микропипетку через другую сторону экспериментальной камеры. По окончании инкубации удалите раствор бета-казеина из камеры, и промойте камеру несколько раз экспериментальным буфером.
Затем добавьте в камеру несколько микролитров раствора везикулы, а затем несколько микролитров гранул, покрытых стрептавидином, до конечной концентрации 0,1 умножить на 10 до отрицательной нормы 3% гранул на объем или меньше. После того, как везикулы и шарики осядут на дно камеры, дайте экспериментальному буферу испариться в течение примерно 15 минут, после чего везикулы должны заметно волнисто извиваться под световым микроскопом. Когда везикулы достаточно гибкие, отсасывайте отдельные везикулы в микропипетку до тех пор, пока длины мембран внутри пипетки не станут равны или больше радиуса пипетки.
Когда будет определен аспирационный язычок подходящего размера, запечатайте открытые края камеры минеральным маслом. Чтобы установить нулевое положение давления аспирации, расположите конец аспирационной пипетки рядом с шариком и отрегулируйте высоту резервуара для воды таким образом, чтобы шарик не всасывался и не сдувался пипеткой. Регулировка высоты воды имеет решающее значение для контроля натяжения мембраны везикулы, которая всасывается микропипеткой.
Вдохните пузырь и переместите микропипетку вверх и из фокуса, не ломая микропипетку. С помощью оптического пинцета захватите бусину на расстоянии примерно 20 микрометров от дна камеры. Верните везикулу в фокус подальше от валика и выровняйте его по оптической ловушке, а затем запишите движение валика в течение одной-двух минут, чтобы измерить положение равновесия.
Уменьшите давление внутри микропипетки настолько, насколько это возможно, не теряя везикулы, чтобы уменьшить натяжение мембраны, и осторожно приведите везикулу в контакт с шариком примерно на секунду, чтобы установить связи стрептавидина и биотина. Затем, используя пьезопривод, аккуратно потяните везикулу назад, чтобы создать нанотрубку. Увеличьте давление аспирации, чтобы воссоздать аспирационный язычок, и выровняйте трубку по оси аспирационного пипетки.
Полностью сфокусируйте трубку и везикулу и запишите движение шарика со скоростью захвата 30 Гц и высоту резервуара для воды по отношению к нулевому положению в течение нескольких минут с помощью светлопольной микроскопии. Когда все изображения будут получены, снова запишите движение шарика при различных давлениях аспирации и натяжении мембраны. Чтобы ввести интересующие вас белки или молекулы, поднесите микропипетку к нанотрубке, следя за тем, чтобы шарик в оптической ловушке не был нарушен, и осторожно введите белки с давлением в один-два паскаля.
После того, как связывание с белками уравновесится, повторите ступенчатые измерения в присутствии добавленных белков, как показано на примере голой мембраны. Измерения силы и радиуса на нанотрубках, извлеченных из везикул со 100% DOPC, являются независимыми, так как сила измеряется от смещения шарика в оптической ловушке, а радиус — от интенсивности флуоресценции, что позволяет рассчитать жесткость мембраны при изгибе. Относительное обогащение белков BAR или калиевых каналов на мембранных трубках над нижележащими везикулами указывает на то, что белки с большей вероятностью связываются с изогнутыми мембранами.
Действительно, связывание белка N-BAR эндофилина А2 с мембраной постепенно снижает усилие в трубке до нуля, что указывает на образование трехмерного каркаса, который поддерживает стабильность трубки. После этой процедуры можно комбинировать другие методы для ответа на дополнительные вопросы, например, микроскопия высокого разрешения для обнаружения организации белка на мембранных трубках или отслеживание отдельных частиц для измерения подвижности белка.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен метод извлечения мембранных нанотрубок из липидных везикул для изучения взаимодействий между белками и изогнутыми мембранами in vitro. Этот подход позволяет количественно оценить связывание белков с такими мембранами и их механические свойства, что позволяет прояснить фундаментальные процессы, такие как эндоцитоз и внутриклеточный транспорт.
Основные компоненты исследования
Область исследования
- Клеточная биология
- Динамика мембран
- Белок-мембранные взаимодействия
Теоретические основы
- Понимание того, как белки влияют на кривизну мембраны, имеет решающее значение для клеточных процессов.
- Исследование искривленных мембран помогает раскрыть механизмы, участвующие в эндоцитозе.
- Механика мембран играет важную роль в внутриклеточном транспорте.
Используемые методы
- Методика вытягивания нанотрубок для изучения взаимодействий белков с искривленными мембранами.
- Гигантские однослойные везикулы в качестве модельных систем.
- Оптические пинцеты и микроскопия для измерения свойств мембран.
Основные результаты
- Количественно определено, как такие белки, как эндофилин A2, взаимодействуют с мембранными нанотрубками и стабилизируют их.
- Продемонстрированы механические свойства липидных мембран на примере различных наблюдаемых эффектов.
- Получены данные о преимущественном связывании белков с искривленными мембранами.
Выводы
- Данное исследование подчеркивает важность кривизны мембраны в белковых взаимодействиях.
- Представленный метод может способствовать дальнейшему изучению клеточных процессов и биологии мембран.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Этот метод позволяет проводить количественный анализ взаимодействий белков с кривизной мембраны, обеспечивая понимание механизмов эндоцитоза и путей внутриклеточного транспорта. Измеряя связывание белков с мембранами с высокой кривизной и их механические эффекты, данный подход способствует валидации мишеней и снижает риски на ранних этапах разработки мембранно-ассоциированных терапевтических средств. Метод обеспечивает прогностическую уверенность в функциях белков, связывая молекулярные взаимодействия с фенотипами ремоделирования мембран.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишеней
- Научная ценность: Позволяет проверять терапевтические гипотезы путем количественного определения связывания белков с искривленными мембранами и их взаимной деформации.
- Операционная ценность: Обеспечивает функциональную валидацию мишеней посредством прямого измерения стабилизации мембраны, индуцированной белками, например, снижение силы до нуля под действием эндофилина A2.
- Прогностическая ценность: Помогает в приоритизации портфеля препаратов путем выявления белков, которые преимущественно связываются с мембранами с высокой кривизной, что указывает на их механизм участия в формировании везикул.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Подготавливает валидированные системы «белок–мембрана» для последующего скрининга, обеспечивая одновременное измерение кривизны мембраны, натяжения и поверхностной плотности белка.
- Количественные показатели: Генерирует измерения силы и радиуса на основе смещения в оптической ловушке и интенсивности флуоресценции, предоставляя двойные показатели для расчета жесткости на изгиб.
- Воспроизводимость: Стандартизирует контроль натяжения мембраны с помощью аспирации микропипеткой и калибровки нулевого положения, обеспечивая стабильное формирование нанотрубок в разных экспериментах.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболеваний: Моделирует изогнутые клеточные структуры, такие как эндоцитотические перешейки, связывая белково-мембранные взаимодействия с путями везикулярного транспорта, которые задействованы в нейродегенеративных и метаболических нарушениях.
- Трансляционная преемственность: Связывает результаты, полученные in vitro, с клеточным контекстом, позволяя проводить последующие исследования с помощью микроскопии высокого разрешения и трекинга одиночных частиц для оценки организации и мобильности белков на нанотрубках.
- Прогресс с учетом рисков: Обосновывает решения о продолжении или прекращении исследований (go/no-go) за счет количественной оценки того, как белки изменяют механику мембран, что снижает неопределенность при анализе механизмов для минимизации рисков.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод, применяемый на этапе биологического поиска, позволяет проверять гипотезы и уточнять сигнальные пути перед переходом к этапам идентификации соединений-лидеров и доклинической валидации.
- Фундаментальная биология: Позволяет исследовать, как специфические белки распознают или индуцируют кривизну мембран, что проясняет их роль в эндоцитозе и внутриклеточном транспорте.
- Скрининг: Предоставляет готовые к анализу системы со стандартизированной кривизной и натяжением, что обеспечивает надежную оценку соединений или белков.
- Аналитика: Обеспечивает получение данных о силе, радиусе и интенсивности флуоресценции для количественной оценки жесткости изгиба мембран и обогащения белков на нанотрубках.
- Трансляционные исследования: Связывает результаты с доклинической работой, позволяя сопоставлять связывание белков с мембранами in vitro с их клеточной локализацией и динамикой.
- Корпоративное повторное использование: Создает универсальную платформу для изучения различных интересующих белков в рамках нескольких проектов, сокращая необходимость в повторной разработке методов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозирования при валидации мишеней за счет снижения механистической неопределенности в белок-мембранных взаимодействиях.
- Операционная ценность: обеспечивает воспроизводимость благодаря стандартизированной подготовке везикул, контролю натяжения и двухрежимному измерению свойств нанотрубок.
- Стратегическая ценность: повышает эффективность использования капитала, позволяя на ранних этапах принимать решения о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) на основе количественных данных о связывании белков с кривизной мембран.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию мембранно-ассоциированных мишеней с учетом рисков, связывая характер связывания с функциональным ремоделированием мембран.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области микроманипуляций, оптического пинцета и флуоресцентной микроскопии для вытягивания нанотрубок и инъекции белков.
- Метод зависит от наличия специализированного оборудования, включая аспираторы микропипеток, пьезоактуаторы и конфокальные системы для одновременного измерения натяжения, кривизны и плотности белков.
- Необходима межкомандная стандартизация условий буфера, протоколов подготовки везикул и стратегий мечения белков для обеспечения сопоставимости данных.
- При расширении метода на другие липидные составы или белковые системы требуются корректировки, особенно в отношении эффективности связывания биотин-стрептавидин.
- Существуют практические ограничения, такие как необходимость использования высокочистого бета-казеина для пассивации камеры и тщательное предотвращение появления пузырьков при заполнении микропипеток для сохранения достоверности измерений.
