Конфокальный изображений нейропептида Y-pHluorin: техника для визуализации экзоцитоз гранул инсулина в нетронутыми мышиных и человеческих островках

Основная цель данного анализа заключается в визуализации экзоцитоза гранул инсулина в режиме реального времени в интактных островках поджелудочной железы с помощью конфокальной микроскопии. Этот метод позволит ответить на ключевые вопросы в области изучения диабета. Например, что регулирует экзоцитоз инсулина?

Это имеет решающее значение, поскольку слияние гранул является самым важным событием в жизни бета-клетки. Основное преимущество данного метода заключается в том, что мы можем использовать интактные островки и наблюдать процессы слияния в клетках в их естественной среде. Мадина Махмутова, аспирантка нашей лаборатории, продемонстрирует эту методику.

После получения панкреатических островков перенесите их в 50 мл фальконовские пробирки и центрифугируйте суспензию островков при 1 000 об/мин в течение пяти минут. Островки осядут на дно пробирки; перенесите их в 2 мл культуральной среды CMRL в 35-мм чашки Петри, не обработанные для культивирования тканей, и инкубируйте при 37 °C и 5% CO2 в течение 24 часов перед вирусным заражением. После изоляции суспендируйте примерно эквивалент мышиных панкреатических островков в 2 мл культуральной среды CMRL и перенесите их в 35-мм чашки Петри, не обработанные для культивирования тканей.

Инкубируйте ткань при 37 °C и 5% CO2 в течение 24 часов перед вирусным заражением. Для проведения вирусного заражения добавьте от 5 до 10 µL стокового вируса в каждую чашку Петри диаметром 35 мм, содержащую островки человека или мыши в 2 мл культуральной среды CMRL. После культивирования островков в течение 24 часов аспирируйте среду и замените ее двумя мл культуральной среды CMRL без вируса.

Культивируйте островки от четырех до шести дней, заменяя среду каждые три дня. Приготовьте внеклеточный раствор, смешав перечисленные здесь реагенты, после чего стерилизуйте буфер путем фильтрации. Приготовьте базальную среду с глюкозой до конечной концентрации глюкозы 3 mM, добавив 75 µL стокового раствора глюкозы 2 M к 50 mL внеклеточного раствора.

Затем, чтобы приготовить гипергликемическую среду с конечной концентрацией глюкозы 16 мМ, добавьте 400 µL стокового раствора глюкозы с концентрацией 2 М к 50 мл внеклеточного раствора. Разведите любые дополнительные стимулы и внеклеточный раствор, содержащий 3 мМ глюкозы. Перед началом эксперимента обработайте покровные стекла 30 µL раствора поли-D-лизина с концентрацией 1 мг/мл и инкубируйте в течение одного часа.

Затем тщательно промойте покровные стекла водой. По крайней мере за один час до начала эксперимента перенесите группу островков в чашку Петри диаметром 35 мм, содержащую внеклеточный раствор с 3 mM глюкозы. Остальные островки храните при 37 °C и 5% CO2.

За 30 минут до начала эксперимента прикрепите покровное стекло к камере для визуализации, используя силиконовую смазку для герметизации. Затем зафиксируйте камеру для визуализации на платформе для визуализации. После этого с помощью пипетки перенесите от 20 до 30 островков на область покровного стекла, обработанную поли-D-лизином, и оставьте островки на 20 минут для прикрепления к поверхности.

Этот этап имеет решающее значение для успеха эксперимента; мы собираем примерно от 20 до 30 островков в менее чем 10 µL буфера и выдерживаем их в течение 20 минут. Важно не допустить полного высыхания покровного стекла, чтобы избежать повреждения островков. Пока островки прикрепляются к покровному стеклу, подготовьте перфузионную систему, тщательно промыв ее водой.

Затем добавьте каждый раствор в соответствующий канал согласно этой таблице. Удалите все пузырьки воздуха из системы, открывая каждый канал по отдельности и обеспечивая проточность раствора в течение нескольких минут. Убедитесь, что поток стабилен и трубки не протекают.

Затем подключите одноканальный встроенный нагреватель раствора к трубке выхода перфузии и установите температуру вытекающего буфера на 37 °C. После этого подготовьте вакуумный насос. Подсоедините трубки, включите насос и убедитесь, что происходит аспирация жидкости.

Поместите платформу для визуализации с островками на предметный столик микроскопа и подключите ее к системе перфузии и вакуумному насосу. Затем осторожно заполните камеру для визуализации внеклеточным раствором, содержащим 3 мМ глюкозы. Для проведения конфокальной визуализации найдите островки в поле зрения микроскопа при малом увеличении.

После фокусировки на островках переключитесь на объективы с большим увеличением. Откройте программное обеспечение для сбора данных и активируйте встроенный режим сканирования. Выберите режим визуализации xyzt, затем для настройки параметров сбора данных включите аргоновый лазер, установив мощность на 30%, а затем линию лазера 488 нанометров, отрегулировав мощность лазера примерно до 50% для возбуждения pHluorin.

Регистрируйте эмиссию в диапазоне от 505 до 555 нанометров, используя спектр эмиссии EGFP в качестве ориентира. Выберите разрешение 512 на 512 пикселей. Начните получение изображений, нажав кнопку live, и отрегулируйте уровень усиления.

Установите начальную и конечную границы z-стека, сфокусировавшись на верхней части островка и выбрав «begin», а затем перейдя к последней плоскости, на которой можно добиться фокусировки, и выбрав «end». Установите размер z-стека 5 µm. Установите временной интервал между сборами каждого z-стека примерно от 1,5 до 2 секунд и выберите опцию «acquire until stopped» для непрерывной визуализации.

Затем нажмите кнопку пуска для инициализации получения изображений. Протоколы стимуляции для индуцирования экзоцитоза гранул приведены в текстовом протоколе. С помощью встроенного сканера конфокальные изображения островка регистрируются в режиме таймлапса менее чем за две секунды.

Кроме того, этот метод можно сочетать с красителями для функциональной визуализации, такими как красители мембранного потенциала или цитозольного свободного кальция. Чтобы определить, действительно ли NP Y-pHluorin является подходящим инструментом для мониторинга динамики гранул инсулина, инфицированные островки подвергали иммуноокрашиванию антителами к GFP для NP Y-pHluorin и к гормонам островков: инсулину, соматостатину или глюкагону. Большинство клеток, экспрессирующих NP Y-pHluorin, оказались бета-клетками, так как они также экспрессировали инсулин.

Лишь несколько глюкагон-положительных альфа-клеток или соматостатин-положительных дельта-клеток были помечены GFP. Важно отметить, что в инфицированных клетках слияние NP Y колокализовалось с инсулином. Эта фигура демонстрирует, что pHluorin является эффективным pH-сенсором.

Поскольку повышение внутриклеточного pH с помощью 50 мМ хлорида аммония приводило к увеличению внутриклеточной флуоресценции более чем на 500%, при повышении pH внутри гранулы в результате слияния с плазматической мембраной и открытия поры слияния гранулы, содержащие NP Y-pHluorin, становятся видимыми в условиях, стимулирующих экзоцитоз инсулина, например, при деполяризации мембраны хлоридом калия. С помощью конфокальной таймлапс-визуализации островков, инфицированных NP Y-pHluorin, можно наблюдать за единичными секреторными событиями в бета-клетках внутри интактных островков.

Эти явления возникают в ответ на прямую деполяризацию мембраны хлоридом калия или под воздействием нескольких других физиологических стимулов. При базальной концентрации внеклеточной глюкозы секреторная активность выражена слабо. Однако стимуляция высокой концентрацией глюкозы вызывает слияние гранул с плазматической мембраной.

После выполнения данной процедуры можно применить другие методы, такие как иммуногистохимия, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, почему слияние гранул происходит в определенных областях клетки. После разработки этот метод использовался для изучения временного паттерна секреции инсулиновых гранул в популяциях бета-клеток в островках человека.