В пробирке Характеристика электрофизиологических свойств кишечных афферентных волокон в крыс

Общая цель данного протокола состоит в том, чтобы продемонстрировать методологию электрофизиологической регистрации сенсорных нервов толстой кишки in vitro. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы in vitro pen, такие как вклад чувствительности внешних периферических эфференсов в коррекцию гипералгезии. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет различать колоректум таким же образом, как различают сонную артерию in vivo, у животных или у пациентов.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, потому что локализация ганглиев и рассечение нервов относительно сложны. Чтобы начать эту процедуру, обнажите брюшную полость крысы, находящейся под глубоким наркозом, выполнив разрез по средней линии на брюшной стенке с помощью скальпеля. После этого отведите брыжейку и другие ткани в сторону, чтобы обнажить толстую кишку.

Затем поместите животное под препарирующий микроскоп. С помощью тщательного вскрытия найдите левый тазовый ганглий и определите тазовые нервы и соединяющие его поясничные спланхнические нервы. Впоследствии перережьте эти нервы в нескольких миллиметрах от тазового ганглия.

Локализация тазового ганглия и рассечение нервов является наиболее важным и сложным этапом этой процедуры. Далее разрежьте симфизную кость, чтобы обнажить прямую кишку. Удалите ткани над толстой кишкой и будьте осторожны, чтобы оставить тазовый ганглий нетронутым.

После принесения в жертву крысы путем внутривенного введения передозировки пентобарбитала необходимо пересечь толстую кишку примерно на три сантиметра выше тазового ганглия и удалить колоректум у животного с помощью щипцов. Впоследствии переложите колоректум в чашку Петри, заполненную предварительно охлажденным раствором Кребса. Удалите каловые массы, аккуратно промыв толстую кишку.

Далее удалите остатки мочевого пузыря и других тканей аккуратно, не нарушая тазовый ганглий. При этой процедуре толстую кишку помещают в записывающую камеру и непрерывно пропитывают ткань карбогенированным раствором Кребса. Затем канюльизируйте толстую кишку как на оральном, так и на анальном концах, затем начните внутрипросветное вливание толстой кишки с солевым раствором в оральном направлении, после этого найдите большой тазовый ганглий под препарирующим микроскопом и с помощью булавок от насекомых обнажите ганглий.

При тщательном вскрытии найдите тонкую ветвь нерва, выходящую из ганглия и идущую к толстой кишке, затем перережьте нерв рядом с ганглием. Перед следующим шагом включите нагревательную баню и держите раствор Кребса при температуре 34 градуса Цельсия. Теперь осмотрите предварительно вытащенную стеклянную пипетку под препарирующим микроскопом.

Сломайте кончик электрода парой щипцов так, чтобы его размер был сопоставим с диаметром регистрируемого нерва. После этого снимите фаску с кончика, поместив его рядом с более светлым бликом. Новичкам в этой методологии также может быть сложно скос кончика электрода в соответствии с размером нерва.

Далее поместите скошенный электрод в держатель электрода, затем подсоедините шприц объемом 10 миллилитров к боковому порту держателя для приложения отрицательного или положительного давления к электроду. После этого подключите держатель к головному столику биоусилителя, и установите головной столик на манипулятор. После этого переместите электрод в тканевую ванну и заполните электрод раствором Кребса, применяя мягкое всасывание до тех пор, пока он не соприкоснется с серебряным проводом держателя.

Затем поместите кончик электрода близко к отрезанному концу нерва и приложите отрицательное давление, чтобы всосать нерв в электрод. Затем приложите больше отрицательного давления, чтобы около одного миллиметра нерва втянулось в электрод и образовало плотное уплотнение. Теперь включите биоусилитель и установите фильтр на 300 - три тысячи герц.

Контролируйте сигнал на осциллографе и записывайте сигнал нерва и сигнал внутрипросветного давления в программном обеспечении для обработки данных спайков. Затем нанесите рампу на растяжение толстой кишки, закрыв трехсторонний кран на выходной канюле при непрерывном внутрипросветном вливании. Следите за внутрипросветным давлением, пока оно не достигнет 60 миллиметров ртутного столба, затем откройте трехсторонний кран на дренажной канюле.

Повторяйте эту процедуру через равные промежутки времени в пятнадцать минут и применяйте препараты дополнительно или внутрипросветно, чтобы проверить химическую чувствительность афферентных нервов. Ниже приведена схематическая иллюстрация экспериментальной установки для препарата колоректума ex vivo с репрезентативной записью из дистального нерва в тазовый ганглий. В препаратах от нормальных крыс афферентные нервы толстой кишки обычно имеют низкий уровень регулярной спонтанной активности.

Растяжение толстой кишки с помощью рампы вызывает постепенное увеличение скорости стрельбы. Механосенсорные свойства каждого нерва представлены построением кривой ответа афферентного нерва внутрипросветного давления. В качестве альтернативы запись может быть сделана из ветви тазовых нервов, расположенной проксимальнее тазового ганглия.

Профиль механосенсорной активности проксимальных тазовых нервов обычно аналогичен тому, который наблюдается в нерве, расположенном дистальнее тазового ганглия. Анализ главных компонент осциллограмм потенциалов действия от многокомпонентной записи может быть выполнен для различения активности одного блока. Здесь представлены наложенные друг на друга формы волн двух отдельных тазовых афференсов.

После освоения этой техники ее можно выполнить за два часа, если она выполнена правильно. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать анатомию крупных тазовых ганглиев и других нервов, а также уметь находить ганглии, чтобы расчленять нервы и записывать афферентную активность. Преимущество этого протокола заключается в том, что он позволяет сравнивать электрофизиологические свойства и фармакологические профили тазовых и спланхнических афферентных нервов.