Поколение модели хронической обструктивной болезни легких у мышей, воздействие неоднократные озона
25 августа 2017 г.
Это исследование описывает успешное поколения новой модели животных хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), постоянно подвергая мышей в высоких концентрациях озона.
Общая цель этого эксперимента состоит в том, чтобы вызвать хроническую обструктивную болезнь легких или C-O-P-D через воздействие озона, O-E у мышей. Эта новая модель ОЭ может быть использована для характеристики основного механизма ХОБЛ и может быть использована для скрининга новых лекарств. Основные преимущества данной модели ОЭ заключаются в том, что она повторяет патологические процессы у пациентов с ХОБЛ.
Он может быть сгенерирован всего за шесть-восемь недель. Вместе со мной эту процедуру будет демонстрировать Вейджаян Санг, научный сотрудник нашей группы. Чтобы получить озон, используйте электрический генератор и небольшую воздуходувку, чтобы выдуть воздух из герметизирующего бокса Perspex через вентиляционную трубу, подключенную внутри и снаружи бокса, с помощью зонда озона для контроля концентрации озона в боксе.
Когда концентрация озона достигнет 2,5 частей на миллион, поместите мышей в коробку на 3 часа. В конце 7-й недели визуализируйте обработанных озоном животных с помощью микрокомпьютерной томографии в соответствии со стандартными протоколами. Чтобы проверить изменения, вызванные озоном, и функциональные способности, такие как усталость легких, сначала разогрейте мышей со скоростью 10 метров в минуту на беговой дорожке.
Через 5 минут увеличьте скорость до 15 метров в минуту на период 10 минут. Продолжайте увеличивать скорость на пять метров в минуту каждые 30 минут, пока мыши не перестанут бегать. Запись общей дистанции бега и времени бега для каждого животного в виде дистанции усталости и времени усталости соответственно.
Чтобы измерить легочную функцию животных, подвергшихся воздействию озона, поместите мышь под наркозом в плетизмограф, подключенный к аппарату искусственной вентиляции легких, управляемому компьютером. Используйте вентиляцию с контролируемым давлением, чтобы обеспечить животному, находящемуся под наркозом, среднюю частоту дыхания в 150 вдохов в минуту до тех пор, пока не будет получен регулярный ритм дыхания и полное выдох в каждом дыхательном цикле. Затем запишите объем форсированного выдоха в первые 25, 50 и 75 миллисекунд выдоха, отвергая любые неоптимальные маневры.
После терминальной анестезии используйте эндотрахеальную трубку диаметром один миллиметр для двукратного промывания животных одним миллилитром PBS за промывание. Соберите полученные аловаты от каждого животного для центрифугирования и соберите надосадочную жидкость на жидком азоте. Повторно суспензируйте гранулы в свежих PPS для подсчета и оборудуйте по два держателя на мышь со предметным стеклом микроскопа, фильтрующей картой и воронкой.
Добавьте примерно от 100 до 125 микролитров повторно суспендированных клеток в каждую воронку. Загрузите держатели в центрифугу для цитоса и поверните клетки на предметные стекла. Затем нанесите на клетки правильный окрашивающий раствор в соответствии с инструкциями производителя и отсчитайте 200 клеток на мышь при 400-кратном увеличении.
Для забора сердечной крови соберите около 500 микролитров крови у животных, подвергшихся воздействию озона, с помощью пункции сердца. И добавить кровь в 1,5 миллилитровые пробирки со льдом. Через 30 минут на льду центрифугируйте образцы крови и переложите надосадочную жидкость сыворотки в новые пробирки для хранения на жидком азоте.
В дальнейшем образцы могут быть разморожены для оценки уровня экспрессии цитокинов в сыворотке крови с помощью иммуноферментного анализа в соответствии со стандартными протоколами. Для морфометрического анализа легких поместите первую мышь в положение лежа на спине после забора сердца. Затем откройте грудную полость и рассеките платизму и передние мышцы трахеи, чтобы получить доступ к кольцам трахеи.
Извлекайте легкие и трахею, не отделяя сердце от легких. Затем используйте полиэтиленовую трубку PE90 для подключения эндотрахеального катетера к шприцу, содержащему формальдегид мощностью 4%, и полностью накачайте легкие примерно 200 микролитрами параформальдегида. Затем поместите легкие в 15-миллилитровую пробирку, содержащую 10 миллилитров свежего четырехпроцентного формальдегида, по крайней мере, на четыре часа.
По данным микрокомпьютерной томографии, мыши, подвергшиеся воздействию озона, демонстрируют значительно больший общий объем легких и процент низкой площади затухания, чем контрольные животные, подвергшиеся воздействию окружающего воздуха. Фенотип эмфиземы также проявляется в увеличении альвеол легких и увеличении среднего линейного перехвата. Оценка функции легких с помощью плетизмографа показывает, что все параметры, которые снижаются у мышей, подвергшихся воздействию озона, согласуются с типичными функциональными дефектами легких, наблюдаемыми у пациентов с хронической обструктивной болезнью легких.
Кроме того, воздействие озона значительно сокращает время усталости и расстояние усталости при испытаниях на устойчивость к физической нагрузке. Животные, обработанные озоном, также демонстрируют значительное увеличение воспалительных клеток, включая макрофаги и нейтрофилы, а также значительное снижение IL-10 и увеличение IL-1 бета и ФНО-альфа, демонстрируя, что модель воздействия озона повторяет симптомы, подобные хронической обструктивной болезни легких человека. Следуя этой процедуре на других линиях мышей, таких как мыши C57 BR6, можно использовать для создания этой модели OE. После ее разработки этот метод открывает путь исследователям в области легочных заболеваний к изучению основных механизмов ХОБЛ.
Не забывайте, что работа с параформальдегидом может быть опасной, и что при работе с этим реагентом всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение перчаток, защитных очков и использование раствора внутри вытяжного шкафа.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании описывается успешное создание новой животной модели хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) путем многократного воздействия на мышей высоких концентраций озона. Эта модель может быть использована для изучения фундаментальных механизмов развития ХОБЛ и скрининга новых лекарственных препаратов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ)
- Животные модели
- Воздействие озона
Теоретические сведения
- ХОБЛ представляет собой серьезную проблему здравоохранения, характеризующуюся ограничением воздушного потока.
- Существующие модели могут не в полной мере воспроизводить заболевание человека.
- Воздействие озона является потенциальным методом индуцирования ХОБЛ в моделях на животных.
- Данное исследование направлено на разработку надежной модели для исследовательских целей.
Цель исследования
- Индуцировать ХОБЛ у мышей посредством воздействия озона.
- Создать модель, имитирующую патологические процессы при ХОБЛ.
- Обеспечить возможность скрининга лекарственных препаратов и изучения механизмов развития заболевания.
Используемые методы
- Повторное воздействие высоких концентраций озона на мышей.
- Использование электрического генератора и воздуходувки для получения озона.
- Мониторинг концентрации озона с помощью зонда.
- Создание модели завершается через шесть-восемь недель.
Основные результаты
- Была успешно создана новая животная модель ХОБЛ.
- Модель воспроизводит патологические процессы, наблюдаемые у пациентов с ХОБЛ.
- Она служит платформой для дальнейших исследований и тестирования лекарственных препаратов.
- Демонстрация процедуры была проведена научным сотрудником.
Выводы
- Новая модель является ценным инструментом для изучения ХОБЛ.
- Она может помочь в понимании механизмов заболевания.
- Потенциал для скрининга новых терапевтических средств.
Часто задаваемые вопросы
Промышленная значимость для руководителей
Данная модель воздействия озона устраняет критический недостаток в разработке препаратов для лечения ХОБЛ, предлагая быструю и механистически релевантную альтернативу моделям, индуцированным сигаретным дымом. Способность модели воспроизводить ключевые патофизиологические признаки — ограничение воздушного потока, эмфизему, воспаление и снижение переносимости физических нагрузок — в течение 6–8 недель повышает прогностическую достоверность при валидации мишеней и доклиническом скрининге. Модель способствует раннему снижению рисков при проверке терапевтических гипотез, обеспечивая воспроизводимую количественную оценку функции легких и воспалительных биомаркеров, что соответствует потребностям индустрии в обеспечении трансляционной непрерывности и сортировке портфеля препаратов.
Стратегические приложения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, связанные с ограничением воздушного потока и разрушением паренхимы легких, путем количественной оценки снижения FEV25/50/75/FVC.
- Научная ценность: способствует функциональной валидации мишеней путем моделирования озон-индуцированной эмфиземы и воспаления, отражающих этиологию ХОБЛ у человека.
- Практическая ценность: сокращает время создания модели с месяцев до недель, ускоряя исследования по взаимодействию с мишенями и выяснению путей передачи сигналов.
Скрининг и разработка методов анализа
- Научная ценность: Предлагает стандартизированную систему оценки влияния соединений на утомляемость легких, приток воспалительных клеток и сдвиги в уровне цитокинов (например, снижение IL-10, повышение IL-1β/TNF-α).
- Практическая ценность: Обеспечивает воспроизводимость анализа за счет использования согласованных протоколов воздействия озона и функциональных показателей, таких как выносливость на беговой дорожке и плетизмография.
- Практическая ценность: Позволяет масштабировать процессы скрининга благодаря короткому периоду индукции и минимальной технической сложности по сравнению с системами воздействия дыма.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Демонстрирует релевантность модели заболеванию посредством параллельных изменений морфологии легких (расширение альвеол, увеличение среднего линейного перехвата) и иммунного профиля, наблюдаемых при ХОБЛ у людей.
- Научная ценность: Обосновывает снижение механистических рисков, связывая воздействие озона с патогенными путями, включающими нейтрофилию, накопление макрофагов и дисрегуляцию цитокинов.
- Практическая ценность: Позволяет проводить лонгитюдную оценку терапевтического вмешательства в отношении функционального снижения и структурных повреждений на этапах от поиска лекарственных средств до доклинических исследований.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данная модель вписывается в континуум процесса разработки — от валидации мишени до оптимизации ведущих соединений, предоставляя воспроизводимую платформу для оценки эффективности соединений по конечным точкам, релевантным для ХОБЛ, перед началом доклинических инвестиций.
- Поисковая биология: Обеспечивает проверку гипотез на основе измеримого снижения функции легких и увеличения содержания воспалительных медиаторов после воздействия озона.
- Скрининг: Предоставляет количественные стандартизированные показатели (индексы ОФВ, время/дистанция до утомления, количество клеток в БАЛЖ) для перехода от стадии поиска хитов к оптимизации соединений-лидеров.
- Аналитика: Формирует многомерные наборы данных (функциональные, морфометрические, иммунологические), позволяющие проводить сравнительный анализ между группами лечения.
- Трансляционные исследования: Связывает этап поиска и доклиническую фазу путем моделирования этиологически значимого воздействия окружающей среды (озона), связанного с патогенезом ХОБЛ у человека.
- Корпоративное повторное использование: Создает воспроизводимую и эффективную с точки зрения времени модель для итерационного тестирования различных мишеней и модальностей в рамках программ по изучению легочных заболеваний.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность за счет моделирования известного фактора риска ХОБЛ у человека (озона) с измеряемыми патологическими и функциональными исходами.
- Операционная ценность: повышает воспроизводимость и пропускную способность благодаря стандартизированным рабочим процессам воздействия, функционального тестирования и обработки тканей.
- Стратегическая ценность: повышает эффективность использования капитала за счет сокращения временных и ресурсных затрат на создание моделей, что позволяет быстрее принимать решения о целесообразности дальнейшей разработки.
- Влияние на портфель: поддерживает риск-ориентированное продвижение за счет получения ранних сигналов эффективности в модели с трансляционной внешней и конструктивной валидностью.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области ингаляционной токсикологии, проведения функциональных проб легких и методов бронхоальвеолярного лаважа.
- Необходимо наличие оборудования для генерации и мониторинга озона, бодиплетизмографа, микротома, а также оборудования для проведения анализа цитокинов методом ELISA или проточной цитометрии.
- Требуется межгрупповая стандартизация продолжительности воздействия, концентрации (2.5 ppm) и протоколов функционального анализа для обеспечения сопоставимости данных.
- При переносе результатов на разные линии мышей следует учитывать необходимость адаптации в связи с возможной вариабельностью чувствительности к озону.
- Возможности ограничены необходимостью применения терминальной анестезии при проведении функциональной и гистологической оценки, что исключает возможность долгосрочного неинвазивного мониторинга.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:05
Title
0:52
Ozone Air Exposure and Treadmill Test
2:17
Pulmonary Function Measurements
3:05
Broncheoalveolar Lavage Fluid (BALF) Collection
4:25
Cardiac Blood Sampling and Lung Morphometric Analysis
6:06
Results: Representative Chronic Obstructive Pulmonary Disease Mouse Model
7:29
Conclusion
