Подсчет белков в одиночных клетках с адресно капелька Microarrays

Общая цель этого эксперимента заключается в определении абсолютного числа копий белка-мишени с разрешением для одной клетки. Методы работы с одиночными клетками позволят лучше понять поведение белка в его отношении к центральной догме и помогут в точной количественной оценке контролируемой экспрессии генов. Работа на уровне отдельных клеток может уловить богатую гетерогенность клеточной популяции, которая в противном случае была бы потеряна из-за усреднения, происходящего при использовании традиционных биохимических методов.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности из-за чувствительности анализов отдельных клеток или ограниченного количества белка в каждой клетке. Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы хотели провести анализ белка одной клетки, который можно было бы легко взять для дальнейшего анализа. Начните эту процедуру с изготовления чипов и печати микрочипов антител, как описано в текстовом протоколе.

Чтобы подготовить аппарат, подайте трубку PFA длиной 100 миллиметров с внутренним диаметром 150 микрон и внешним диаметром 360 микрон на трубку из плавленого кремнезема длиной 40 миллиметров с внутренним диаметром 1 миллиметр и внешним диаметром 1/16 дюйма до тех пор, пока она не выступит на два миллиметра. Таким образом будет формироваться концентрическая насадка. Нанесите тонкий слой цианоакрилатного клея на конец наконечника пипетки объемом 10 микролитров и вставьте его в 40-миллиметровый кусок трубки PFA.

При необходимости переместите трубку из плавленого кремнезема так, чтобы сохранить выступ в 2 миллиметра на сопле до того, как клей схватится. Вставьте другой конец капилляра из плавленого кремнезема в конец трубки из ПТФЭ длиной 200 миллиметров с внутренним диаметром 014 дюймов и внешним диаметром 062 дюйма. Подключите его к 100-микролитровому шприцу Hamilton, наполненному четырехпроцентным белком бычьей сыворотки в фосфатно-солевом буфере.

Затем вставьте трубку FEP длиной 400 миллиметров и внутренним диаметром 1 миллиметр и внешним диаметром 2 миллиметра в наконечник пипетки объемом 200 микролитров до тех пор, пока не образуется уплотнение. Нанесите тонкий слой цианоакрилатного клея на другой наконечник пипетки объемом 200 микролитров, затем вставьте его в первый наконечник, чтобы зафиксировать трубку на месте. Затем подсоедините открытый конец трубки FEP к 1-миллилитровому шприцу Hamilton, наполненному минеральным маслом.

Вставьте наконечник для пипетки объемом 200 микролитров в наконечник для пипетки объемом 10 микролитров концентрической насадки. Затем наполните шприц объемом 100 микролитров 4-процентным раствором для блокировки PBSA. Снова присоедините и промойте водную трубку блокирующим раствором.

Повторите дважды, чтобы получить в общей сложности три флеша. Затем наполните 100-микролитровый шприц антителом для обнаружения 0,125 микрограмма на литр в 4-процентном PBSA и снова прикрепите трубку. Замените блокирующий раствор в трубке, выпустив 25 микролитров раствора антител для обнаружения.

Промойте масляную трубку минеральным маслом до тех пор, пока все трубки и форсунка не заполнятся маслом. Затем наполните 1-миллилитровый шприц минеральным маслом и снова прикрепите трубку. Наконец, закрепите трубку и сопло в сборе на манипуляторе XYZ.

Чтобы образовать адресные капли, закрепите чип на предметном столике микроскопа. Запишите координаты предметного стола микроскопа для каждой точки в массиве с помощью программного обеспечения для автоматического управления микроскопом. Далее устанавливаем манипулятор XYZ на предметный столик микроскопа.

Поместите шприцы в отдельные шприцевые насосы, так как они должны работать независимо. Расположите насадку под углом от 50 до 60 градусов. Затем установите водяной шприцевой насос на подачу 10 нанолитров по 100 микролитров в минуту, а масляный шприцевой насос установите на диспергирование 5 микролитров со скоростью 100 микролитров в минуту.

Дозируйте водный раствор до тех пор, пока в головке сопла не будет видна капля жидкости. Промокните валик беспыльной салфеткой, чтобы удалить ее. С помощью программного обеспечения для автоматизированного управления микроскопом установите координаты предметного стекла микроскопа на пятно антитела в матрице и сфокусируйтесь на поверхности скольжения крышки.

При выравнивании насадки будьте осторожны, чтобы не нарушить пятно антитела. Будьте особенно внимательны и обязательно наблюдайте за приближением стеклянного капиллярного наконечника через микроскоп. Стараясь не повредить пятно, с помощью манипулятора XYZ выровняйте стеклянный капиллярный кончик концентрической насадки по бокам пятна антитела.

После выравнивания выдавите 10 нанолитров водного раствора. Не двигая ступеней, налейте пять микролитров масла, чтобы покрыть водный раствор. Медленно поднимите сопло подальше от капли и перейдите к следующей лунке.

Повторите этот шаг для всех пятен антител в массиве. Через 30 минут визуализируйте все пятна на матрице с помощью автоматизированного программного обеспечения для управления микроскопом, чтобы определить фон отдельных молекул, связанных с каждым пятном антитела, прежде чем загружать клетки. Чтобы загрузить клетки адресными каплями, мы суспендировали клетки в растворе детектирующего антитела размером 0,125 мкг/миллилитр в средах L-15 с 10-процентным содержанием FDS.

Отфильтруйте раствор ячейки через сетчатый фильтр с шагом 40 микрон, чтобы получить суспензию за одну ячейку. Загрузите отдельные клетки в адресуемые капли из клеточного резервуара с помощью микроманипулятора и микрокапилляра. Наблюдая с помощью объектива 10x, используйте микроинъектор для аспирации одной клетки в микрокапилляр из клеточного резервуара.

Работая вручную с помощью джойстика, заливайте автоматически с помощью функции извлечения электронного манипулятора. Откажитесь от микропипетки, переместив ее вверх, чтобы освободить высоту чипа на 1 миллиметр. Установите координаты предметного столика на координаты адресуемой капли с помощью программного обеспечения для автоматического управления микроскопом.

Введите микропипетку, вернув ее в сохраненное Z-положение. Выполняйте это вручную с помощью джойстика или автоматически, если используется электронный манипулятор ножа. Механические процессы, вызванные лазерным лизисом, могут привести к образованию эмульсии на краю капли, что более высокие импульсные энергии могут полностью разрушить капли.

Убедитесь, что энергия импульсов лизиса сведена к минимуму, а клетки не откладываются на непосредственном краю капель. Диспенсируйте клетки в адресной капле с помощью микроинъектора. Визуализируйте клетки в каплях с помощью светлопольной микроскопии, включая любую флуоресцентную визуализацию.

Также визуализируйте все пятна на массиве с помощью одномолекулярной микроскопии TIRF. Сосредоточьтесь на клетке в адресной капле. Обеспечьте полный оптический лизис путем фокусировки одного 6-наносекундного лазерного импульса вблизи места расположения клетки.

Обратите внимание на время, в течение которого каждая клетка лизируется. Получайте изображения всех пятен с помощью микроскопии TIRF каждые десять минут в течение первых 30 минут, а затем каждые 20 минут в течение следующих 60 минут. Если вас интересует только количество белка, связанного в равновесии, визуализируйте все пятна после инкубации чипа в течение 90 минут при комнатной температуре.

Чтобы выполнить подсчет одиночных молкулей для любого незастойного пятна антител, загрузите фоновое изображение, полученное до лизиса. На Фиджи выберите фоновое изображение. В меню изображения выберите «Дублировать», чтобы дублировать фон.

Затем выберите дубликат изображения и на вкладке фильтров процесса выберите размытие по Гауссу и укажите радиус 50 пикселей. Перейдите к процессу и выберите калькулятор изображений. Там указывается разделение операции, необходимые изображения, затем выбираются окошки, создающие новое окно и 32-битный результат.

Вычтите каждый пиксель на изображении на единицу. Затем выберите область размером 50 на 50 пикселей в любом из четырех углов на фоновом плоском изображении. Измерьте стандартное отклонение интенсивности пикселей, выбрав «Анализировать» и «Измерить».

В разделе Настройка изображения выберите порог и установите нижний пороговый уровень равным трем стандартным отклонениям. В сегментированном изображении SM mask установите значения интенсивности пикселей равными нулю для любых объектов, которые не имеют размера от четырех до девяти квадратных пикселей и окружности от 0,5 до 1. Для этого выберите «Анализировать», а затем «Анализировать частицы» и укажите размер и круглость.

Для одних и тех же пятен антител загрузите и повторите шаги анализа данных для всех кадров изображения, полученных в виде временного ряда-результата, полученного после лизиса. В репрезентативных результатах изображений с использованием одной молекулы сигнал на фоновых изображениях показывает более низкий уровень неспецифического связывания флуоресцентно меченного детектирующего антитела с поверхностью и пятном антитела. На увеличенном изображении на врезке выделены отдельные молекулы с красными стрелками.

Также показано типичное изображение вытягивания p53 в клетках карциномы толстой кишки человека с ПБ. Эта последовательность изображений показывает накопление белка p53 в пятне антитела. Калибровочная кривая, полученная с использованием известных концентраций комбинантного белка, используется для преобразования количества одномолекулярных белков в каждом пятне в число белков-мишеней в анализируемом объеме и указывает на число копий одной клетки.

Горизонтальная красная пунктирная линия указывает на уровень неспецифической привязки. Экспрессия базального белка p53 в раковых клетках BE демонстрирует длиннохвостое гамма-подобное распределение, при котором экспрессия белка p53 в некоторых клетках значительно выше модального значения. Здесь экспрессия белка p53 отображается в зависимости от объема клетки, рассчитанного на основе измеренного диаметра клетки до лизиса.

Результаты показывают, что в этих клетках поддерживается минимальная концентрация белка p53. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как измерить распространенность белка-мишени с разрешением по одной клетке. При работе с биологическими клетками важно помнить, что белки могут разрушаться.

После освоения этой техники она может быть завершена в течение четырех часов, если она выполнена правильно, и может быть включена в протоколы анализа первичных образцов пациентов. Методы работы с одиночными клетками могут помочь получить представление о клеточных функциях и поведении, а также выявить редкие события, которые в противном случае были бы пропущены обоими методами. Хотя этот метод может дать представление о биологии p53 и клеточных линий рака молочной железы, он также может быть применен к другим исследованиям заболеваний без необходимости мечения, что полезно при изучении первичных клеток из образцов пациентов.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как ПЦР на квантовых точках, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как определение корреляции между РНК-мишенью и экспрессией белка. Измерение абсолютного числа копий белка будет привлекательным для биоматематиков и ученых-вычислителей в поддержку их биологических моделей.