Использование рекомбинантных комаров Densovirus как вектор доставки генов для функционального анализа генов в личинки комаров

Общая цель данной процедуры заключается в анализе функций генов личинок комаров с использованием рекомбинантного денсовируса комаров в качестве средства доставки генов. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы о системах доставки на основе вирусов, например, о том, как преодолеть соответствующие внеклеточные и внутриклеточные барьеры. Основными преимуществами этих методов являются простота манипуляций, высокая эффективность трансдукции, длительное и стабильное использование экспрессии, а также способность вызывать стойкие эффекты in vivo.

В данной работе было продемонстрировано, что с помощью разработанной системы доставки на основе денсовируса в личинках комаров можно осуществлять гиперэкспрессию или нокдаун специфических малых РНК или генов-мишеней. Значимость этого метода расширяет возможности применения описанной стратегии экспрессии для изучения биологии комаров, так как данный подход позволяет легко проводить трансдукцию личинок. Процедуру продемонстрирует Пэй-Вэнь Лю, докторант нашей лаборатории.

Начните с заказа химического синтеза полноразмерных последовательностей кДНК для предшественников миРНК, миРНК-губок и шРНК, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. После получения заказанной ДНК центрифугируйте пробирки с блоками ДНК, чтобы вся высушенная ДНК оказалась на дне пробирки. Затем ресуспендируйте ДНК в воде, не содержащей ДНКазу, до достижения конечной концентрации 10 ng/µL.

Добавьте 6 µL XbaI для рестрикции плазмидного остова и последовательностей кДНК, и инкубируйте реакционную смесь при 37 °C в течение одного часа. Затем проведите дефосфорилирование 5'-концов линеаризованного плазмидного остова с помощью щелочной фосфатазы кишечника теленка в соответствии с инструкциями производителя. Для эффективной упаковки размер генома не должен превышать 4 400 нуклеотидов, что составляет 110% длины генома денсовируса комаров дикого типа; альтернативно, в геном Aedes aegypti может быть введена экспрессия интронной микроРНК длиной не более 400 нуклеотидов.

Затем проведите тепловую инактивацию щелочной фосфатазы при 65 °C. После этого проведите электрофорез ДНК в 1% агарозном геле и вырежьте полосу с линеаризованным остовом. Выделите ДНК из фрагмента геля с помощью набора для экстракции из геля, следуя инструкциям производителя.

После экстракции лигируйте фрагмент ДНК в вектор, используя Т4 ДНК-лигазу. Затем с помощью теплового шока трансформируйте продукты реакции лигирования в компетентные клетки E.coli штамма DH5-alpha. Высейте трансформированные бактерии на чашку с LB-агаром, содержащим 100 µg/mL ампициллина.

На следующий день выберите одну колонию с чашки и создайте стартовую культуру, используя 3 mL обогащенной среды, содержащей 100 µg/mL ампициллина. В завершение выделите плазмидную ДНК из бактериальной культуры с помощью набора для мини-препарации в соответствии с инструкциями производителя. Отправьте образец ДНК в компанию по секвенированию ДНК для верификации.

Лигируйте pre-miRNA или shRNA в сайт HpaI кодирующей области NS1 AaeDV в плазмидном остове pUCA, используя методы, описанные для искусственной интронной экспрессионной кассеты малых РНК. Вместо клеток DH5-alpha трансформируйте ДНК в компетентные клетки E.coli Stbl3. Затем высейте трансформированные клетки на чашку с LB-агаром, содержащим 100 µg/mL ампициллина, и создайте стартовую культуру из положительного клона. После этого выделите плазмиду rAaeDV из бактериальных клеток с помощью набора для макси-препарации в соответствии с инструкциями производителя.

В нулевой день перенесите клетки C6/36 из флаконов с конфлюэнтностью 90–95% в соотношении от 1:1 до 1:2 в 10 культуральных флаконов T-25. Инкубируйте флаконы в течение 18–20 часов при 28 °C до повторного достижения конфлюэнтности 90–95%.

В первый день проведите трансфекцию клеток с помощью полученных плазмид rAaeDV. Для этого разведите 10 micrograms ДНК в 600 microliters среды RPMI-1640 и осторожно перемешайте раствор. Тем временем подготовьте 600 microliters среды RPMI-1640 и 25 microliters реагента для трансфекции на каждую трансфекцию.

Инкубируйте клетки с ДНК в течение 5–10 минут при комнатной температуре. Затем добавьте 625 microliters смеси реагента для трансфекции в RPMI-1640 к смеси плазмидной ДНК и инкубируйте полученную смесь в течение 20–30 минут при комнатной температуре. После инкубации дважды промойте клетки средой RPMI-1640, а затем добавьте смесь для трансфекции в каждую из культуральных колб T-25.

Инкубируйте клетки в смеси для трансфекции в течение шести часов при 28 °C. По истечении шести часов удалите среду для трансфекции, дважды промойте клетки пятью миллилитрами среды RPMI-1640, а затем добавьте свежую среду RPMI-1640, содержащую 10% FBS. Через пять дней после трансфекции с помощью стеклянной пипетки объемом пять миллилитров отделите и суспендируйте клетки в чашках, многократно перенося их вверх-вниз с культуральной средой.

Перенесите клеточные суспензии из каждой колбы в отдельные стерильные пробирки объемом 50 мл. Для сбора вируса с высоким порогом зависимости необходимо поддерживать клетки в течение пяти дней после трансфекции. Заморозьте отдельные пробирки при температуре -80 °C или в бане с этанолом и сухим льдом в течение 30 минут.

Затем быстро разморозьте их при 37 °C и перемешайте клеточную суспензию на вортексе в течение одной минуты. Далее соберите супернатант из центрифугированного образца, а осадок удалите. Затем пропустите супернатант через одноразовый шприцевой фильтр с размером пор 0,22 мкм.

Разделите и храните итоговые очищенные стоки вирионов при температуре -80 °C. Промойте 100 личинок A. albopictus первого возраста трижды, используя деионизированную воду. Затем перенесите личинок в стакан, содержащий 95 мл деионизированной воды.

Добавьте 5 mL стоковых растворов rAaeDV и инкубируйте личинок в течение 24 часов при 28 °C. Для успешного заражения личинок необходимо, чтобы они находились в контакте с вирусными частицами от 24 до 36 часов для обеспечения высокого процента инфицирования. После инкубации трижды промойте личинок деионизированной водой, а затем перенесите их обратно в планшеты. Регулярно кормите личинок. С помощью стандартных методов количественной ПЦР или вестерн-блоттинга контролируйте уровень экспрессии целевого гена в личинках.

В данном примере было проанализировано экспрессией эндогенных miRNA у 100 личинок первого возраста после заражения рекомбинантным вирусом, содержащим экспрессионную кассету aal-let-7, которая демонстрирует гиперэкспрессию.

Эффективность конструкции anti-let-7 показана справа, что подчеркивает ее способность к нокдауну. Для оценки эффективности нокдауна мРНК V-ATPase векторами rAaeDV в общей сложности 100 личинок первого возраста подвергли воздействию равных количеств rAaeDV различных типов, добавляя вирус в воду среды обитания личинок. Уровни мРНК V-ATPase были существенно снижены при использовании rAaeDV, экспрессирующего miRNA, и rAaeDV, экспрессирующего интронную shRNA.

Наши результаты подтверждают эффективность стратегии интронной экспрессии, предлагающей новую парадигму, которая позволяет преодолеть ограничения денсовирусов комаров с дефектным геномом для обеспечения эффективной доставки чужеродных генов в организм комаров. При выполнении данной процедуры важно помнить, что в геном денсовируса Aedes aegypti может быть встроена экспрессионная кассета микроРНК в интроне длиной не более 400 nt. После разработки этот метод открыл возможности для исследований по созданию недефектных рекомбинантных денсовирусов комаров, способных сверхэкспрессировать или подавлять экспрессию микроРНК и целевых генов для проведения функционального анализа генов комаров.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как использовать разработанную систему доставки денсовируса комаров для анализа функций генов в личинках комаров.