На месте MHC-Тетрамер окрашивание и количественный анализ для определения местоположения, изобилия и фенотип антиген специфические CD8 Т-клеток в тканях

Общей целью этой процедуры является определение расположения, распространенности и фенотипа антиген-специфических CD8-положительных Т-клеток в тканях, представляющих интерес. Этот метод помогает быстро ответить на вопросы о CD8 Т-клетках, предоставляя средства для обнаружения, количественного определения и фенотипирования практически любой антиген-специфичной CD8 Т-клетки и любой ткани. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет определить пространственное распределение антигенспецифичных CD8-положительных Т-клеток относительно других клеток и структур в представляющих интерес тканях.

Демонстрировать процедуру с Шэнбинь Ли будет Гвантва Мвакалундва. В первый день процедуры с помощью скальпеля разрежьте свежую ткань примерно на кусочки размером 0,5 х 0,5 сантиметра. Здесь показана ткань селезенки макак-резуса.

Отдельно приклейте каждый фрагмент ткани в середину верхней части поршня и заделайте образцы в три-пять миллилитров теплой агарозы с низким содержанием таящейся агарозы в PBS. Наклейте на поршни соответствующую информацию о салфетке. Затем поместите образцы в охлажденный держатель в ведро со льдом.

Когда агар застынет, включите микротом и установите настройку толщины на 200 микрометров. После установки нового лезвия бритвы вставьте вантузы в ванночку с микротомом. Наполните ванну микротома от 100 до 200 миллилитров свежеприготовленного PBS-H и добавьте кубики льда PBS-H, чтобы поддерживать температуру в диапазоне от нуля до двух градусов по Цельсию.

После получения срезов размером 200 микрометров с помощью кисти удалите агар, окружающий каждый срез, и перенесите образцы в отдельные тканевые камеры в отдельных лунках 24-луночного планшета для культуры тканей, содержащего один миллилитр охлажденного PBS-H. Когда все образцы будут получены, инкубируйте срезы тканей в течение ночи в одном миллилитре подходящих конъюгированных пептидных тетрамеров MHC класса один, разведенных в PBS-H с добавлением 2% нормальной козьей сыворотки при температуре четыре градуса Цельсия с покачиванием. На следующее утро перенесите каждую тканевую камеру в отдельные лунки нового планшета на 24 лунки, содержащего один миллилитр свежего охлажденного PBS-H на 20 минут.

После второй стирки закрепите срезы в одном миллилитре свежего 4%-ного параформальдегида на два часа при комнатной температуре. Затем следуют два пятиминутных промывания в холодном PBS-H. Переложите срезы в новую 24-луночную пластину, содержащую 0,01 молярной мочевины, и разогрейте срезы в микроволновой печи три раза в течение примерно 10 секунд каждый раз, пока мочевина не закипит.

Для проникновения и блокирования образцов инкубируйте участки в блокирующем растворе, содержащем PBS-H с добавлением 0,3% тритона x100 и 2% обычной козьей сыворотки на коромысле в течение одного часа, при четырех градусах Цельсия. В конце инкубации перенесите тканевые камеры в отдельные лунки нового 24-луночного планшета, содержащего один миллилитр раствора, содержащего антитело против фитка кролика, антитело к CD у мыши и антитело к человеку CD3 у крысы. Инкубируйте образцы в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия с покачиванием.

На третий день промойте срезы три раза в свежем PBS-H при температуре четыре градуса Цельсия в течение не менее 20 минут за промывку и проведите заключительную инкубацию с соответствующими флуоресцентными конъюгированными вторичными антителами в течение трех дней, защищенных от света. В конце третичной инкубации антител промойте образцы тремя 20-минутными промывками в свежем PBS-H и с помощью малярной кисти перенесите образцы из каждой тканевой камеры на предметное стекло микроскопа. Смажьте каждый участок монтажным материалом, дополненным флуорофорным консервантом, и накройте образцы покровным стеклом.

Затем храните предметные стекла в легком защищенном контейнере для предметных стекол при температуре 20 градусов Цельсия. В день визуализации поместите первое предметное стекло на предметное стекло конфокального микроскопа и выберите подходящие лазеры и фильтры для каждого флуорофора, используемого для маркировки образца ткани. Используя объектив 20x, последовательно получить серию z с интервалом в три микрона в каждом из каналов флуорофора в нескольких полях размером 800 x 800 пикселей.

Затем постройте монтаж из собранных полей и сохраните каждое изображение монтажа с именем, основанным на соответствующем образце ткани. На этих репрезентативных изображениях срез, окрашенный тетрамеров MHC класса один, загруженных пептидом SIV, сравнивают со срезом той же ткани, окрашенным тетрамеров MHC класса один, загруженных нерелевантным пептидом, что демонстрирует специфичность окрашивания тетрамером. На этих изображениях вирус-специфические Т-клетки, окрашенные тетрамером MHC класса один, загруженным пептидом SIV, ко-окрашивают CD8, маркер субпопуляции Т-клеток, но не CD20, белок клеточной поверхности, экспрессируемый на В-клетках.

Этот монтаж был создан для множественных конфокальных полей z-серии, которые использовались для количественной оценки окрашенных тетрамеров клеток с определенными фенотипами и различными анатомическими компартментами на лимфатическом узле. На этом увеличенном изображении выделена область монтажного лимфатического узла, содержащая фолликул В-клеток, очерченный окрашиванием IGM. Окрашенные тетрамеры MHC класса один, некоторые из которых совместно экспрессируют маркер активации и пролиферации Т-клеток, KI67, могут быть обнаружены внутри и снаружи фолликула В-клеток.

Эта комбинация окрашивания позволяет определить статусы активации и пролиферации специфичных для SIV CD8-положительных Т-клеток, а также их локализацию во вторичных лимфоидных тканях. После освоения этой техники она может быть завершена примерно за пять дней, если она выполнена правильно. Пытаясь провести эту процедуру, важно помнить, что свежая ткань имеет решающее значение для успешного окрашивания.

Обработайте образцы в течение 24 часов или менее после сбора, сохраняя их охлажденными до фиксации. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее представление о том, как проводить окрашивание тетрамером и иммуногистохимию для определения локализации, обилия и фенотипа антигенспецифических CD8-положительных Т-клеток в тканях, представляющих интерес. Не забывайте, что работа с инфекционными агентами может быть чрезвычайно опасной, и что при выполнении этой процедуры всегда следует принимать меры предосторожности для предотвращения контакта, такие как ношение соответствующих средств индивидуальной защиты и ограничение использования острых предметов.