На месте MHC-Тетрамер окрашивание и количественный анализ для определения местоположения, изобилия и фенотип антиген специфические CD8 Т-клеток в тканях

Общая цель данной процедуры — определить локализацию, количество и фенотип антигенспецифических CD8-положительных Т-клеток в исследуемых тканях. Этот метод позволяет быстро получить ответы на вопросы о CD8 Т-клетках, предоставляя возможность локализовать, количественно оценить и фенотипировать практически любую антигенспецифическую CD8 Т-клетку в любой ткани. Главным преимуществом данной техники является то, что она позволяет определить пространственное распределение антигенспецифических CD8-положительных Т-клеток относительно других клеток и структур в исследуемых тканях.

Процедуру совместно с Shengbin Li будет демонстрировать Gwantwa Mwakalundwa. В первый день процедуры с помощью скальпеля разрежьте свежую ткань на фрагменты размером примерно 0,5 x 0,5 сантиметра. В данном примере показана ткань селезенки макаки-резуса.

Отдельно приклейте каждый фрагмент ткани в центр верхней части поршня и залейте образцы тремя-пятью миллилитрами теплого 4% низкоплавящего агарозы в PBS. Маркируйте поршни, указав соответствующую информацию о тканях. Затем поместите образцы в охлажденный держатель в ведерке со льдом.

Когда агар затвердеет, включите микротом и установите толщину среза на 200 micrometers. После установки нового лезвия поместите планжеры в кювету микротома. Наполните кювету микротома от 100 до 200 milliliters свежеприготовленного PBS-H и добавьте кубики льда из PBS-H для поддержания температуры в диапазоне от zero до two degrees celsius.

После получения срезов толщиной 200 мкм с помощью кисти удалите агар вокруг каждого среза и перенесите образцы в отдельные тканевые камеры в лунки 24-луночного планшета для культивирования тканей, содержащего 1 мл охлажденного PBS-H. После сбора всех образцов инкубируйте срезы тканей в течение ночи в 1 мл тетрамеров MHC I класса, конъюгированных с соответствующим пептидом и разведенных в PBS-H с добавлением 2% нормальной сыворотки козы, при температуре 4 °C в условиях перемешивания на качалке. На следующее утро перенесите каждую тканевую камеру в отдельные лунки нового 24-луночного планшета, содержащего 1 мл свежего охлажденного PBS-H, на 20 минут.

После второй промывки зафиксируйте срезы в одном миллилитре свежего 4%paraformaldehyde в течение двух часов при комнатной температуре. Затем проведите две промывки в холодном PBS-H по пять минут каждая. Перенесите срезы в новый 24-луночный планшет, содержащий 0,01 molar мочевины, и подвергните их воздействию микроволнового излучения трижды по 10 секунд до закипания мочевины.

Для пермеабилизации и блокировки образцов инкубируйте срезы в блокирующем растворе, содержащем PBS-H с добавлением 0,3% Triton X-100 и 2% нормальной сыворотки козы, на шейкере в течение одного часа при 4 °C. По окончании инкубации перенесите камеры с тканью в отдельные лунки нового 24-луночного планшета, содержащего один миллилитр раствора с кроличными антителами к FITC, мышиными антителами к CD человека и крысиными антителами к CD3 человека. Инкубируйте образцы в течение ночи при 4 °C при постоянном перемешивании на шейкере.

На третий день трижды промойте срезы в свежем PBS-H при температуре 4 °C в течение не менее 20 минут каждую промывку и проведите финальную инкубацию с соответствующими конъюгированными флуоресцентными вторичными антителами в течение периода до трех суток в защищенном от света месте. По завершении инкубации с третичными антителами промойте образцы трижды по 20 минут в свежем PBS-H, а затем с помощью кисти перенесите образцы из каждой камеры с тканью на предметное стекло микроскопа. Нанесите на каждый срез среду для заключения, дополненную консервантом флуорофора, и накройте образцы покровным стеклом.

Затем храните предметные стекла в светозащитном контейнере при 20 °C. В день проведения визуализации поместите первое стекло на предметный столик конфокального микроскопа и выберите соответствующие лазеры и фильтры для каждого флуорофора, использованного для маркировки образца ткани. Используя объектив 20x, последовательно получите z-серию с интервалом 3 мкм в каждом из каналов флуорофоров в нескольких полях размером 800 x 800 пикселей.

Затем создайте монтаж из собранных полей зрения и сохраните каждое изображение монтажа под именем, соответствующим образцу ткани. На этих репрезентативных изображениях срез, окрашенный тетрамерами MHC I класса, нагруженными SIV-пептидом, сравнивается со срезом той же ткани, окрашенным тетрамерами MHC I класса, нагруженными иррелевантным пептидом, что демонстрирует специфичность окрашивания тетрамерами. На данных изображениях вирус-специфичные T-клетки, окрашенные тетрамером MHC I класса с SIV-пептидом, также окрашиваются на CD8, маркер подмножества T-клеток, но не на CD20, поверхностный клеточный белок, экспрессируемый B-клетками.

Данный монтаж был создан на основе нескольких полей конфокальных z-серий, которые использовались для количественного анализа окрашенных тетрамерами клеток со специфическими фенотипами в различных анатомических отделах лимфатического узла. На этом увеличенном изображении выделена область монтажа лимфатического узла, содержащая B-клеточный фолликул, очерченный окрашиванием на IGM. Клетки, окрашенные тетрамерами MHC I класса, некоторые из которых коэкспрессируют маркер активации и пролиферации T-клеток KI67, обнаруживаются как внутри, так и вне B-клеточного фолликула.

Данная комбинация окрашиваний позволяет определить статус активации и пролиферации SIV-специфических CD8-положительных T-клеток, а также их локализацию во вторичных лимфоидных тканях. При правильном выполнении освоенная методика занимает примерно пять дней. При проведении данной процедуры важно помнить, что использование свежей ткани является критическим фактором для успешного окрашивания.

Обработайте образцы в течение 24 часов или менее после сбора, поддерживая их в охлажденном состоянии до момента фиксации. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить окрашивание тетрамерами и иммуногистохимический анализ для определения локализации, количества и фенотипа антигенспецифических CD8-положительных Т-клеток в исследуемых тканях. Не забывайте, что работа с инфекционными агентами может быть крайне опасной, и при выполнении данной процедуры следует всегда соблюдать меры предосторожности для предотвращения заражения, такие как использование соответствующих средств индивидуальной защиты и ограничение использования острых предметов.