Лаборатория протокол для генетических кишки содержание анализа водных макробеспозвоночных использование конкретных групп рДНК грунтовки

Общая цель этого протокола заключается в улучшении исследований трофической экологии, особенно на основе полевых образцов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области экологии пищевых сетей, такие как влияние инвазивных видов на трофические взаимодействия. Основным преимуществом является дополнительное применение для большего времени интеграции трофических анализов для одних и тех же образцов, а также то, что его может применять практически каждый эколог.

Несмотря на то, что мы разработали этот подход для того, чтобы получить представление о потреблении добычи водными потребителями, он также может быть применен для других целей, например, для определения видового состава в образцах бентических макробеспозвоночных. Демонстрировать процедуру будет Кристиан Содеманн, техник из нашей лаборатории. Чтобы начать этот эксперимент, перенесите ранее вскрытый желудочно-кишечный тракт хищника в двухмиллилитровую реакционную пробирку, содержащую 440 микролитров буфера для экстракции соли.

Немедленно заморозьте образцы при температуре минус 20 градусов Цельсия до извлечения ДНК. После извлечения образцов из морозильной камеры начните извлечение ДНК с помощью щипцов, чтобы добавить одну пятимиллилитровую бусину из нержавеющей стали в каждую пробирку с образцами, а затем оставьте образцы на столе при комнатной температуре для оттаивания. С помощью бисерной мельницы гомогенизируйте образцы в течение одной минуты при частоте 15 герц.

После короткого вращения образцов добавьте в образцы 90 микролитров 10% SDS и пять микролитров 10 мг на миллилитр протеиназы К. Далее тщательно перебейте образцы в вихрь и инкубируйте их при температуре 60 градусов Цельсия с постоянным встряхиванием при 400 оборотах в минуту на термомиксере в течение одного часа. Чтобы еще больше стимулировать лизис, каждые 10 минут в течение этой инкубации делайте вихревые операции с образцами.

После короткого отжима центрифугирования пипеткой введите в образцы 350 микролитров пяти моляров хлорида натрия. Вортексируйте от 30 секунд до одной минуты для полного перемешивания образцов. Затем центрифугируйте при 16, 200 раз больше g при пяти градусах Цельсия в течение 40 минут.

Таким образом, одним из наиболее важных моментов при извлечении образцов из центрифуги является предотвращение движения шариков и нарушения гранулы, содержащей все частицы, которые необходимо удалить на каждом этапе. Затем осторожно перелейте примерно 600 микролитров надосадочной жидкости в новую 1,5-миллилитровую пробирку, следя за тем, чтобы не потревожить гранулу. Добавьте 600 микролитров ледяного изопропанола и осторожно переверните трубку несколько раз.

Хранить при температуре минус 20 градусов Цельсия в течение ночи. После извлечения образцов из морозильной камеры центрифугируйте их при 16, 200 раз g при комнатной температуре в течение 20 минут. Выбросьте надосадочную жидкость, убедившись, что она не потеряна, и тщательно высушите тюбик с помощью папиросной бумаги.

Промойте эти гранулы, содержащие ДНК, добавив 200 микролитров 70% ледяного этанола, а затем центрифугируйте при 16, 200 г при комнатной температуре в течение 10 минут. С осторожностью выбросьте надосадочную жидкость и используйте безворсовую папиросную бумагу, чтобы тщательно высушить трубку. Наконец, с помощью дозатора объемом 10 микролитров, отрегулированной до восьми микролитров, осторожно удалите остатки надосадочной жидкости, следя за тем, чтобы не потревожить гранулу.

Высушите гранулу до тех пор, пока весь этанол не испарится. Затем добавьте от 50 до 100 микролитров воды, не содержащей нуклеаз, быстро перемешайте и оставьте при температуре четыре градуса Цельсия на ночь, чтобы гранула растворилась. Чтобы проверить функциональную эффективность извлеченных здесь образцов ДНК, протестируйте каждый из них методом ПЦР с использованием универсальных наборов праймеров, подходящих для соответствующего источника пищи.

Начните с добавления праймеров, смеси dNTP, реакционного буфера, Taq-ДНК-полимеразы и очищенной воды в реакционную пробирку объемом 1,5 или 2,5 миллилитра и вортексируйте стандартную реакционную смесь. Теперь для каждого образца ДНК перенесите один микролитр соответствующего экстракта ДНК в девять микролитров стандартной реакционной смеси в ПЦР-планшете. Закройте планшет, поместите его в термоамплификатор и запустите программу ПЦР.

После завершения ПЦР-реакции используйте вариант мини-центрифуги с коротким тиражом для раскрутки продуктов ПЦР. Затем смешайте по три микролитра каждого продукта ПЦР с одним микролитром шестикратной загрузки красителя. Загрузите эти образцы в гелевые прорези предварительно приготовленного агарозного геля.

Загрузите 1,5 микролитра лестницы из 100 пар оснований ДНК в один слот геля в качестве стандартного размера. Закройте крышку установки для электрофореза, подключите ее к источнику питания и запустите гель при напряжении 100 вольт на сантиметр в течение 35 минут. После проведения электрофореза удалите гель и поместите его в заранее подготовленную ванночку для окрашивания примерно на 10 минут.

Наконец, извлеките гель из ванны для окрашивания, поместите его в систему документирования геля и визуализируйте его в соответствии с инструкцией. Для анализа содержимого кишечника хищника используют заранее приготовленные рабочие растворы экстракта ДНК. Проведите отдельные ПЦР-реакции для каждого из 16 наборов праймеров, специфичных для группы жертв.

Включите один положительный контроль с ДНК образца, принадлежащего к соответствующей группе добычи, и один отрицательный контроль с ДНК вида хищника. Крайне важно точно задокументировать распределение образцов в каждой ПЦР-планшете, чтобы избежать объединения различных образцов при загрузке их на секвенирующую пластину для обнаружения секвенатора распределения и, в конечном итоге, присвоения неправильных результатов потребителю. Затем запустите реакции ПЦР с использованием того же протокола, что и описанный ранее, скорректированный в соответствии с конкретной температурой отжига и номером цикла для каждого используемого набора праймеров.

Чтобы обнаружить амплифицированные фрагменты в этих реакциях ПЦР, запустите автоматический анализ фрагментов в двух партиях, А и В. Приготовьте смесь, содержащую раствор для загрузки образца или SLS, и соответствующий стандарт размера для каждой партии. Затем разморозьте ранее замороженные продукты ПЦР восьми ПЦР-реакций, принадлежащих соответствующей партии, убедившись, что они хранятся в темноте. Используйте вариант мини-центрифуги с коротким ходом, чтобы раскрутить их.

На планшет для секвенирования загрузите количество лунок, соответствующее количеству анализируемых образцов, 22 микролитрами соответствующей стандартной смеси размера SLS для каждого образца. Затем загрузите по одному микролитру продукта ПЦР каждой из восьми ПЦР-реакций в соответствующие лунки планшета. Затем используйте вариант мини-центрифуги с коротким ходом, чтобы осторожно раскрутить эту смесь.

После этого залейте каждую лунку по одной капле минерального масла. Затем заполните реакционные лунки буферной пластины 250-300 микролитрами буфера для разделения ДНК. Используйте программное обеспечение капиллярного секвенсора для создания образца в соответствии с инструкциями производителя.

Убедитесь, что распределение образцов в выборочной установке совпадает с распределением проб в секвенционной пластине и что выборочная установка содержит метод, подходящий для обработки соответствующей партии. При анализе результатов важно визуально перепроверить электроферограмму каждого образца и подтвердить/не подтвердить каждый вызванный пик для каждого набора маркерных праймеров отдельно, а также вручную вставить неназванные пики, которые соответствуют критериям набора маркерных праймеров, или удалить неправильные. После проведения экспериментов по кормлению для определения эффективности группоспецифических наборов праймеров, установленных для ПЦР-анализов, выполненных в этом протоколе, результаты ПЦР с использованием ДНК из желудочно-кишечного тракта хищника были проанализированы с использованием электрофореза в агарозном геле, а также одноцепочечного конформационного полиморфизма, или SSCP.

Электрофорез в агарозном геле выявил одиночные полосы двухцепочечной ДНК, которые не могли быть различимы между различными изученными видами добычи. В отличие от этого, электрофорез SSCP был успешным в различении различных видов жертв путем сравнения образцов содержимого кишечника с эталонными образцами. ДНК, извлеченная из кишечника водяного клеща после эксперимента с кормлением, была секвенирована в разные периоды времени после употребления добычи.

В период от одного до 50 часов после кормления относительное количество обнаруженной ДНК добычи значительно снижалось. ДНК, извлеченная из инвазивного амфипода, Dikerogammarus villosus gut, была протестирована на ДНК добычи макробеспозвоночных с использованием 16 группоспецифичных наборов праймеров, описанных в этом протоколе. Только 16% содержимого кишечника D.villosus было положительным на ДНК, принадлежащую любому из 16 целевых таксонов добычи.

Кроме того, ДНК 12 проверенных таксонов добычи была обнаружена по крайней мере в одном образце, в то время как ДНК четырех таксонов так и не была обнаружена. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что используемые праймеры специфичны для таксонов в вашей системе. После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как расширить свои исследования трофических взаимодействий, дополнив методы, обычно используемые в вашей лаборатории, генетическим анализом.