Стереотаксическая Атлас руководствуясь лазерная захватить Microdissection регионов мозга, пострадавших от травмы
11 сентября 2017 г.
Мы описывают использование лазерных захвата microdissection для получения образцов различных клеточных популяций из мозга различных регионов для анализа генов и микроРНК. Эта техника позволяет исследования дифференциальных последствий черепно-мозговой травмы в конкретных регионах мозга крысы.
Общая цель данного протокола лазерной захватывающей микродиссекции заключается в сборе клеток из специфических областей мозга, пораженных в результате черепно-мозговой травмы, для последующего молекулярного анализа. Я — доктор Хелен Хеллмих. Мой аспирант Харрис Вейз, студент программы по патофизиологии человека и трансляционной медицине здесь, в медицинском филиале Техасского университета, продемонстрирует, как мы используем методы лазерной захватывающей микродиссекции в наших исследованиях травм головного мозга.
Данный метод может помочь выяснить механизмы и последствия изменений, вызванных ЧМТ в отдельных областях мозга, таких как фронтальная кора, которая контролирует исполнительные функции, и гиппокамп, имеющий важное значение для процессов, зависящих от памяти. Основным преимуществом данной методики является возможность изучения влияния патологического процесса на несколько отдельных областей мозга или отдельные типы клеток в пределах одного и того же мозга.
Перед любой процедурой LCM, включающей транскрипционный анализ, очистите все поверхности моющим средством, удаляющим РНказы, чтобы снизить риск контаминации и деградации РНК. Извлеките ткань мозга из места хранения и поместите ее в криостат, охлажденный до -20 °C.
Дайте мозгу уравновеситься по температуре с камерой криостата в течение примерно десяти минут. Поместите мозг вентральной стороной вверх на марлевую салфетку на платформе криостата. С помощью чистого лезвия для РНК отсеките заднюю часть непосредственно ростральнее мозжечка и часть непосредственно антериальнее зрительного перекреста.
Поместите небольшое количество оптимальной среды для криозаморозки (OCT) в две отдельные криоформы. Поместите мозг, содержащий фронтальную ассоциативную кору и ядро nucleus accumbens, в одну криоформу внутренней стороной вниз. Добавьте достаточное количество среды OCT, чтобы полностью покрыть ткань.
Повторите этот шаг с фрагментом ткани мозга, содержащим гиппокамп и супрахиазматическое ядро. Дайте среде OCT полностью замерзнуть в криостате в течение примерно 20 минут. После полного замерзания ткани и среды OCT выдавите небольшое количество OTC на адаптер для крепления образцов.
Прижмите замороженную криоформу к монтажной головке и дождитесь полного застывания OCT, чтобы форма с тканью была надежно закреплена на головке. Зафиксируйте крепление головки на держателе для сечения и затяните винт. С помощью регулировочных рычагов настройте угол реза относительно ножа криостата, чтобы обеспечить равномерное получение срезов.
Установите толщину среза 30 мкм. При изготовлении срезов блока ткани, содержащего гиппокамп и SEN, продолжайте серирование до тех пор, пока зрительный перекрест не станет плоским на уровне брегмы 0,48 мм и не станет виден третий желудочек. Затем соберите срезы для СЭМ, начиная с этой точки, осторожно помещая предметные стекла с полиэтиленнафталатным мембранным покрытием комнатной температуры поверх срезанной ткани.
Визуально убедитесь в прилипании препарата к предметному стеклу, подтвердив, что ткань и OCT полностью расплавились на стекле. Храните все предметные стекла со срезами тканей в криостате до окрашивания. Прекратите сбор срезов на уровне брегмы 0.72 mm, когда начинается перекрест надзрительных пучков.
Для сбора гиппокампа выполняйте серийные срезы до тех пор, пока рога гранулярного слоя зубчатой извилины не станут видны на уровне брегмы 3.00 мм. Продолжайте сбор срезов до тех пор, пока субполя CA гиппокампа не сольются на корональных срезах на уровне брегмы 4.78 мм. Это обеспечивает полный сбор гиппокампа в области трепанации и места повреждения.
Перед окрашиванием промойте всю лабораторную посуду и рабочую зону для окрашивания в вытяжном шкафу с использованием детергента, удаляющего РНКазы. Извлеките кассету с предметными стеклами из криостата и поместите ее в вытяжной шкаф. Дайте стеклам нагреться в течение 30 секунд.
Окрасьте срезы крезиловым фиолетовым и промойте физиологическим раствором. Оставьте штатив с окрашенными предметными стеклами высыхать на воздухе при комнатной температуре в вытяжном шкафу не более чем на десять минут. После высыхания немедленно приступайте к LCM.
Перед началом любой процедуры LCM для анализа РНК протрите зону сбора образцов и область вокруг устройства детергентом, удаляющим РНКазы, и 100% этанолом. Переключите выключатель питания на блоке генерации инфракрасного лазера перед включением основания микроскопа и дождитесь инициализации системы, прежде чем запускать программное обеспечение с рабочего стола. После загрузки программного обеспечения и завершения этапов инициализации откройте панель настроек программы и нажмите кнопку present stage.
Модульный столик переместится в позицию, где можно загружать и выгружать макроколпачки и предметные стекла для LCM. Поместите до трех предметных стекол с мембраной в держатели матовым краем направо. Выберите область обработки колпачков и стекол рядом с соответствующим стеклом и установите флажок MEM, чтобы сообщить программному обеспечению о загрузке предметных стекол с мембраной.
Затем нажмите на слайд, который необходимо захватить первым. Чтобы получить мозаичное изображение для определения местоположения и ориентации ткани при установке колпачков, выберите image на панели инструментов и выберите acquire overview. Наведите курсор на нужную область на мозаичном изображении, щелкните правой кнопкой мыши и выберите place cap at region center.
Программное обеспечение автоматически установит колпачок над выбранной позицией. После локализации инфракрасного и УФ-лазеров выберите опцию рисования от руки на панели инструментов выбора. С помощью стилуса сенсорного экрана обведите периметр области интереса, следя за тем, чтобы не было потери контакта между сенсорным экраном и наконечником стилуса.
Убедитесь, что начальная и конечная точки соединены между собой. Для сбора образцов гиппокампа проведите лазерный захват подполей CA1, CA2 и CA3 гиппокампа, начиная с уровня брегмы 3.00 мм, используя полностью сформированный гранулярный слой зубчатой извилины в качестве физического ориентира для морфологической идентификации. После сбора переместите макроколпачки LCM в позицию контроля качества (QC) и проверьте полноту прилипания ткани, визуально убедившись, что вырезанная под воздействием УФ-излучения ткань прикреплена к мембране.
Крайне важно, чтобы УФ-лазер произвел разрез по всему периметру ткани. В противном случае ткань прикрепится к колпачку LCM не полностью. Затем быстро поместите каждый колпачок в тонкостенную реакционную пробирку объемом 0.5 мл, не содержащую РНКаз, с 100 µL буфера для лизиса клеток.
Кратковременно перемешайте образцы на вортексе для обеспечения полного лизиса и храните при температуре -80 °C до начала последующего геномного анализа. Ниже представлены репрезентативные изображения срезов тканей, взятых с эпилатеральной стороны места повреждения с использованием функций инфракрасного и УФ-лазера системы LCM. Это область фронтальной ассоциативной коры.
На этом изображении показан тот же участок после сбора. А здесь представлена ткань на колпачке после сбора. На этом изображении видны компоненты парамеальных слоев CA1, CA2 и CA3 гиппокампа, расположенные рядом с полностью сформированными рогами гранулярного слоя зубчатой извилины.
Были собраны образцы из областей CA2 и CA3; данные популяции клеток видны на крышке. Здесь была выбрана область ядра прилежащего (nucleus accumbens core), проксимально-адрострально по отношению к передней комиссуре, что было точно воспроизведено на крышке. Наконец, после ЧМТ методом LCM было выделено супрахиазматическое ядро, расположенное рострально по отношению к супраоптическому перекресту.
После освоения данной методики обработка одного мозга занимает примерно восемь часов. Это время включает подготовку ткани, окрашивание и LCM. После выполнения данной процедуры могут быть применены другие методы, такие как эпигенетический анализ, для изучения паттернов метилирования или микроэкспрессии.
После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить LCM в нескольких областях одного и того же мозга.
Обзор
В данной статье описывается использование метода лазерной захватывающей микродиссекции (LCM) для выделения специфических популяций клеток из различных областей мозга крысы с целью анализа экспрессии генов и микроРНК. Данная методика позволяет глубже понять дифференциальное воздействие черепно-мозговой травмы (ЧМТ) на отдельные области мозга, такие как фронтальная кора и гиппокамп.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Клеточная биология
- Молекулярный анализ
Теоретические основы
- ЧМТ может вызывать различные эффекты в разных областях мозга.
- Понимание этих эффектов на клеточном уровне требует применения точных методов отбора проб.
- ЛКМ позволяет проводить таргетный анализ конкретных типов клеток без контаминации.
- Данное исследование имеет как практическое, так и методологическое значение для нейробиологических исследований.
Цель исследования
- Использование метода лазерной микродиссекции (LCM) для изоляции клеток мозга, поврежденных в результате ЧМТ.
- Анализ экспрессии генов и микроРНК, имеющих отношение к ЧМТ.
- Выяснение молекулярных последствий ЧМТ в селективных областях мозга.
Используемые методы
- В качестве основной платформы используется лазерная микродиссекция (LCM).
- Биологическая модель представлена тканями мозга крыс, в частности областями, затронутыми ЧМТ.
- В исследовании установлены критические сроки подготовки тканей, секционирования и окрашивания.
- На протяжении всего протокола особое внимание уделяется мерам по предотвращению контаминации.
Основные результаты
- Успешная изоляция целевых популяций клеток из таких областей, как фронтальная кора и гиппокамп.
- Понимание изменений на молекулярном уровне, индуцированных ЧМТ, что послужит основой для будущих исследований механизмов патогенеза.
- Определение критических этапов секционирования и окрашивания для надежного сбора РНК.
Выводы
- В исследовании показано, как лазерная микродиссекция (LCM) может способствовать проведению направленного молекулярного анализа последствий ЧМТ.
- Результаты позволяют лучше понять нейронные механизмы, затронутые в результате травмы.
- Данный метод повышает точность исследований в области нейробиологии и открывает возможности для поиска терапевтических подходов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Лазерная микродиссекция (LCM) позволяет проводить точное молекулярное профилирование отдельных областей мозга, пораженных в результате черепно-мозговой травмы (ЧМТ), что способствует валидации мишеней посредством пространственно-разрешенного анализа экспрессии генов и микроРНК. Этот подход снижает влияние искажающих сигналов от гетерогенных тканей, повышая достоверность прогнозов при механистической оценке рисков путей развития ЧМТ. Изолируя регион-специфические ответы у одного и того же животного, LCM улучшает трансляционную преемственность и приоритизацию портфеля исследований в области нейронаук.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем выделения областей, пораженных при ЧМТ, таких как фронтальная кора и гиппокамп, для выяснения соответствующих сигнальных путей.
- Практическая ценность: обеспечивает биологически обоснованную валидацию мишеней с помощью пространственно-разрешенного молекулярного анализа без артефактов, возникающих при диссоциации тканей.
- Прогностическая ценность: способствует приоритизации портфеля разработок путем установления связи между региональными изменениями экспрессии генов и функциональными исходами в исполнительных процессах и процессах памяти.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для последующего геномного анализа путем сохранения пространственной целостности и нативного расположения областей мозга.
- Практическая ценность: Повышение стандартизации и воспроизводимости анализа за счет секционирования с использованием анатомических ориентиров по атласу мозга крысы.
- Ценность масштабируемости: Обеспечение надежной оценки соединений путем получения количественных регион-специфичных молекулярных данных из отдельных областей мозга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная ценность: Обеспечивает сохранение релевантности заболеванию, позволяя анализировать изменения экспрессии генов и микроРНК, вызванные ЧМТ, в анатомически определенных областях мозга.
- Преклиническая преемственность: Поддерживает принятие решений о продвижении проекта с учетом рисков, позволяя проводить лонгитюдное молекулярное профилирование на этапах от поиска до доклинических исследований.
- Механистическое снижение рисков: Сосредоточена на прогностической ценности путем выделения причинно-следственных молекулярных изменений в отдельных областях, а не усредненных показателей по всей ткани.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
ЛКМ вписывается в континуум открытий — от идентификации мишени через оптимизацию соединений-лидеров до доклинической валидации, что позволяет проводить анализ механизмов ЧМТ на основе выдвинутых гипотез в ключевых областях мозга.
- Фундаментальная биология: способствует проверке гипотез и уточнению сигнальных путей путем выделения специфических популяций клеток из пораженных травмой областей, таких как ядро прилежащего ядра и супрахиазматическое ядро.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа за счет стандартизированного секционирования по определенным координатам брегмы и обработки в условиях отсутствия РНаз для получения надежного выхода РНК.
- Аналитика: предоставляет количественные измерения зависимых переменных, включая профили экспрессии генов и микроРНК из тканей, выделенных с помощью лазерного захвата.
- Трансляционные исследования: связывает фундаментальные открытия с доклинической работой, позволяя проводить эпигенетический анализ и анализ метилирования после LCM, как указано в протоколе.
- Корпоративное повторное использование: функционирует как универсальный метод, применимый к различным моделям заболеваний, при этом принципы метода применимы к исследованиям геномной экспрессии в других контекстах травм или заболеваний.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышение прогностической достоверности за счет валидации мишеней и устранения механистической неоднозначности при анализе путей развития ЧМТ.
- Операционная ценность: Стандартизация, воспроизводимость и масштабируемость благодаря секционированию на криостате, использованию атласов и рабочим процессам с контролем активности РНказы.
- Стратегическая ценность: Обоснование более точных решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go), эффективность использования капитала и снижение биологических рисков на поздних стадиях за счет изоляции специфических для конкретных регионов молекулярных ответов.
- Влияние на портфель: Приоритизация с учетом рисков и принятие решений о продвижении проектов на основе пространственно-разрешенного согласования биомаркеров.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области нейроанатомии, криостатного сечения и использования оборудования для лазерной микродиссекции захвата.
- Процесс зависит от обеспечения среды, свободной от РНказ, наличия криостата при -20°C, использования среды для оптимальной температуры резания (OCT) и систем УФ/ИК-лазеров.
- Необходима межкомандная стандартизация протоколов окрашивания, сбора срезов и загрузки колпачков между группами специалистов по нейробиологии и молекулярной биологии.
- При адаптации метода следует учитывать корректировку координат сечения относительно брегмы для различных областей мозга и моделей животных.
- Практические ограничения включают необходимость тщательного контроля загрязнения и техническое мастерство при трассировке УФ-лазером для обеспечения полного прилегания ткани.
