Стереотаксическая Атлас руководствуясь лазерная захватить Microdissection регионов мозга, пострадавших от травмы
11 сентября 2017 г.
Мы описывают использование лазерных захвата microdissection для получения образцов различных клеточных популяций из мозга различных регионов для анализа генов и микроРНК. Эта техника позволяет исследования дифференциальных последствий черепно-мозговой травмы в конкретных регионах мозга крысы.
Общая цель этого протокола микродиссекции с лазерным захватом заключается в сборе клеток из определенных областей мозга, пострадавших от черепно-мозговой травмы, для молекулярного анализа. Я доктор Хелен Хеллмих. Мой ассистент Харрис Вайс, студент программы патофизиологии человека и трансляционной медицины в медицинском отделении Техасского университета, собирается продемонстрировать, как мы используем методы микродиссекции лазерного захвата в наших исследованиях травм головного мозга.
Этот метод может помочь выяснить механизмы и последствия вызванных ЧМТ изменений в дискретных областях мозга, таких как лобная кора, которая контролирует исполнительные функции. И гиппокамп, который важен для процессов, зависящих от памяти. Основное преимущество этого метода заключается в том, что мы можем изучить влияние патологического процесса на несколько дискретных областей мозга или отдельные типы клеток одного и того же мозга.
Перед любой процедурой LCM, включающей транскрипционный анализ, очистите все поверхности с помощью моющего средства, устраняющего RNace, чтобы снизить риск загрязнения и деградации РНК. Извлеките мозговую ткань из хранилища. И поместить в охлажденный до минус 20 градусов по Цельсию циростат.
Дайте мозгу уравновеситься до температуры криостатной камеры в течение примерно десяти минут. Поместите мозг вентральной стороной вверх на марлевую простыню поверх ступени криостата. Чистым лезвием бритвы с помощью РНК отрежьте заднюю часть прямо рострально от мозжечка и часть, расположенную прямо перед зрительным нервом.
Поместите небольшое количество среды с оптимальной температурой резки в две отдельные криоформы. Поместите мозг, содержащий лобную ассоциативную кору и прилежащее ядро, в одну криоформу внутренней стороной вниз. Добавьте достаточное количество ОКТ-среды, чтобы покрыть ткань.
Повторите этот шаг с кусочком мозговой ткани, содержащим гиппокамп и супрахиазматическое ядро. Дайте среде ОКТ полностью застыть в течение примерно 20 минут в криостате. Как только ткань и среда ОКТ полностью замерзнут, выдавите небольшое количество безрецептурного препарата на монтажную головку.
Прижмите замороженный криомольд к монтажной головке и дайте ОКТ полностью замерзнуть, чтобы форма, содержащая ткань, была надежно прикреплена к головке. Закрепите крепление головки на креплении для секции и затяните винт. Отрегулируйте угол реза по отношению к лезвию криостата с помощью регулировочных рычагов, чтобы обеспечить равномерную резку секций.
Установите толщину сечения равной 30 мкм. При разрезании тканевого блока, содержащего гиппокамп и SEN, разрез до тех пор, пока хиазма зрительного нерва не будет сплющена на 0,48 миллиметра, когда станет виден третий желудочек. Затем соберите срезы для СЭМ с этой точки, аккуратно поместив полиэтиленовые нафталатные мембранные салазки комнатной температуры поверх срезанной ткани.
Визуально убедитесь в прилегании к предметному стеклу, подтвердив, что ткань и безрецептурный препарат полностью расплавились на предметном стекле. Храните все предметные стекла с тканевыми срезами в криостате до окрашивания. Остановите сборные секции на брегме 0,72 миллиметра, когда начнется супраоптическая декуссация.
Для забора гиппокампа разрез до тех пор, пока роги гранулярного клеточного слоя зубчатой извилины не станут видны на брегме 3,00 миллиметра. Собирайте срезы до тех пор, пока подполя СА гиппокампа не сольются в корональные срезы при брегме 4,78 мм. Это позволяет полностью собрать гиппокамп под местом трепанации черепа и травмы.
Перед окрашиванием вымойте всю посуду и место окрашивания в вытяжном шкафу с моющим средством, устраняющим РНКазу. Возьмите стойку с бортиками от криостата и поместите в вытяжной шкаф. Дайте предметным стеклам нагреться в течение 30 секунд.
Покрасьте срезы крезил-фиалкой и процедите солевым раствором. Дайте штативу с окрашенными предметными стеклами высохнуть на воздухе не более десяти минут при комнатной температуре в вытяжном шкафу. После высыхания сразу же приступайте к LCM.
Перед началом любой процедуры LCM для анализа РНК протрите область сбора и область вокруг устройства с помощью моющего средства, устраняющего РНКазу, и 100% этанола. Перед включением основания микроскопа поверните выключатель питания на инфаркционном лазерном генераторе и дождитесь инициализации системы перед запуском программного обеспечения с рабочего стола. После того, как программное обеспечение загружено и запущено, выполните шаги по его инициализации, откройте панель настройки программного обеспечения и нажмите кнопку «Показать этап».
Модульная сцена переместится в положение, где макросы LCM будут загружаться и выгружаться. Поместите до трех направляющих для перьевой мембраны в держатели матовым краем вправо. Выберите область обработки колпачка и предметного стекла рядом с соответствующим предметным стеклом и установите флажок MEM, чтобы сообщить программному обеспечению, что предметные стекла с мембранным стеклом были загружены.
Затем нажмите на нужный слайд, который нужно запечатлеть в первую очередь. Чтобы получить мозаичное изображение для определения местоположения тканей и ориентации для размещения колпачков, выберите изображение на панели инструментов и нажмите кнопку Получить обзор. Наведите курсор на область на мозаичном изображении, щелкните правой кнопкой мыши и выберите «Установить заглавные буквы в центре области».
Программное обеспечение автоматически установит колпачок над выбранной позицией. После обнаружения инфракрасного и ультрафиолетового лазеров выберите параметр рисования от руки на панели выбора инструментов. Используя стилус с сенсорным экраном, проведите по периметру интересующей области, стараясь при этом не потерять контакт между сенсорным экраном и головкой стилуса.
Убедитесь, что начальная и конечная точки соединены вместе. Для сбора гиппокампа лазерный захват подполей гиппокампа CA1, CA2 и CA3, начиная с брегмы 3,00 миллиметров, и с использованием полностью сформированного зернистого слоя зубчатой извилины в качестве физического ориентира морфологической идентификации. После сбора переместите макроколпачки LCM в положение контроля качества и проверьте полную адгезию тканей, визуально убедившись, что ткань, полученная под действием ультрафиолетового излучения, прикреплена к мембране.
Крайне важно, чтобы УФ-лазер разрезал всю ткань. Несоблюдение этого требования приведет к неполному прилеганию тканей к колпачку LCM. Затем быстро поместите каждый колпачок в свободную от РНКазы 0,5 миллилитровую тонкостенную реакционную пробирку, содержащую 100 микролитров клеточного лизусного буфера.
Кратковременно окуните образцы в вихрь, чтобы убедиться в полной лизусе, и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия до тех пор, пока не будете готовы к последующему геномному анализу. Ниже приведены репрезентативные изображения срезов тканей, собранные с эпсилатеральной стороны места повреждения с помощью функций инфракрасного и ультрафиолетового лазера в системе LCM. Это область лобной ассоциативной коры.
На этом изображении показана та же область после сбора. А это салфетка на колпачке после сбора. На этом изображении показаны компоненты парамеатальных слоев гиппокампа СА1, СА2 и СА3, расположенные рядом с полностью сформированными рогами грануального слоя зубчатой извилины.
Были собраны области CA2 и CA3, и эти клеточные популяции видны на крышке. Здесь область ядра прилежащего ядра проксимального адрострального отдела к передней спайке, на которую была направлена цель, точно воспроизвела на колпачке. Наконец, супрахиазматическое ядро рострально к супраоптической хиазме было захвачено LCM после ЧМТ.
После освоения этой техники ее можно использовать для обработки одного мозга примерно за восемь часов. Это включает в себя обработку тканей, окрашивание и LCM. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как эпигенетический анализ, чтобы ответить на вопросы, касающиеся паттернов метилирования или микронной экспрессии.
После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как выполнять ЖКМ на нескольких областях мозга в одном и том же мозге.
Обзор
В данной статье описывается использование метода лазерной захватывающей микродиссекции (LCM) для выделения специфических популяций клеток из различных областей мозга крысы с целью анализа экспрессии генов и микроРНК. Данная методика позволяет глубже понять дифференциальное воздействие черепно-мозговой травмы (ЧМТ) на отдельные области мозга, такие как фронтальная кора и гиппокамп.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Клеточная биология
- Молекулярный анализ
Теоретические основы
- ЧМТ может вызывать различные эффекты в разных областях мозга.
- Понимание этих эффектов на клеточном уровне требует применения точных методов отбора проб.
- ЛКМ позволяет проводить таргетный анализ конкретных типов клеток без контаминации.
- Данное исследование имеет как практическое, так и методологическое значение для нейробиологических исследований.
Цель исследования
- Использование метода лазерной микродиссекции (LCM) для изоляции клеток мозга, поврежденных в результате ЧМТ.
- Анализ экспрессии генов и микроРНК, имеющих отношение к ЧМТ.
- Выяснение молекулярных последствий ЧМТ в селективных областях мозга.
Используемые методы
- В качестве основной платформы используется лазерная микродиссекция (LCM).
- Биологическая модель представлена тканями мозга крыс, в частности областями, затронутыми ЧМТ.
- В исследовании установлены критические сроки подготовки тканей, секционирования и окрашивания.
- На протяжении всего протокола особое внимание уделяется мерам по предотвращению контаминации.
Основные результаты
- Успешная изоляция целевых популяций клеток из таких областей, как фронтальная кора и гиппокамп.
- Понимание изменений на молекулярном уровне, индуцированных ЧМТ, что послужит основой для будущих исследований механизмов патогенеза.
- Определение критических этапов секционирования и окрашивания для надежного сбора РНК.
Выводы
- В исследовании показано, как лазерная микродиссекция (LCM) может способствовать проведению направленного молекулярного анализа последствий ЧМТ.
- Результаты позволяют лучше понять нейронные механизмы, затронутые в результате травмы.
- Данный метод повышает точность исследований в области нейробиологии и открывает возможности для поиска терапевтических подходов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Лазерная микродиссекция (LCM) позволяет проводить точное молекулярное профилирование отдельных областей мозга, пораженных в результате черепно-мозговой травмы (ЧМТ), что способствует валидации мишеней посредством пространственно-разрешенного анализа экспрессии генов и микроРНК. Этот подход снижает влияние искажающих сигналов от гетерогенных тканей, повышая достоверность прогнозов при механистической оценке рисков путей развития ЧМТ. Изолируя регион-специфические ответы у одного и того же животного, LCM улучшает трансляционную преемственность и приоритизацию портфеля исследований в области нейронаук.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем выделения областей, пораженных при ЧМТ, таких как фронтальная кора и гиппокамп, для выяснения соответствующих сигнальных путей.
- Практическая ценность: обеспечивает биологически обоснованную валидацию мишеней с помощью пространственно-разрешенного молекулярного анализа без артефактов, возникающих при диссоциации тканей.
- Прогностическая ценность: способствует приоритизации портфеля разработок путем установления связи между региональными изменениями экспрессии генов и функциональными исходами в исполнительных процессах и процессах памяти.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных биологических систем для последующего геномного анализа путем сохранения пространственной целостности и нативного расположения областей мозга.
- Практическая ценность: Повышение стандартизации и воспроизводимости анализа за счет секционирования с использованием анатомических ориентиров по атласу мозга крысы.
- Ценность масштабируемости: Обеспечение надежной оценки соединений путем получения количественных регион-специфичных молекулярных данных из отдельных областей мозга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная ценность: Обеспечивает сохранение релевантности заболеванию, позволяя анализировать изменения экспрессии генов и микроРНК, вызванные ЧМТ, в анатомически определенных областях мозга.
- Преклиническая преемственность: Поддерживает принятие решений о продвижении проекта с учетом рисков, позволяя проводить лонгитюдное молекулярное профилирование на этапах от поиска до доклинических исследований.
- Механистическое снижение рисков: Сосредоточена на прогностической ценности путем выделения причинно-следственных молекулярных изменений в отдельных областях, а не усредненных показателей по всей ткани.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
ЛКМ вписывается в континуум открытий — от идентификации мишени через оптимизацию соединений-лидеров до доклинической валидации, что позволяет проводить анализ механизмов ЧМТ на основе выдвинутых гипотез в ключевых областях мозга.
- Фундаментальная биология: способствует проверке гипотез и уточнению сигнальных путей путем выделения специфических популяций клеток из пораженных травмой областей, таких как ядро прилежащего ядра и супрахиазматическое ядро.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа за счет стандартизированного секционирования по определенным координатам брегмы и обработки в условиях отсутствия РНаз для получения надежного выхода РНК.
- Аналитика: предоставляет количественные измерения зависимых переменных, включая профили экспрессии генов и микроРНК из тканей, выделенных с помощью лазерного захвата.
- Трансляционные исследования: связывает фундаментальные открытия с доклинической работой, позволяя проводить эпигенетический анализ и анализ метилирования после LCM, как указано в протоколе.
- Корпоративное повторное использование: функционирует как универсальный метод, применимый к различным моделям заболеваний, при этом принципы метода применимы к исследованиям геномной экспрессии в других контекстах травм или заболеваний.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышение прогностической достоверности за счет валидации мишеней и устранения механистической неоднозначности при анализе путей развития ЧМТ.
- Операционная ценность: Стандартизация, воспроизводимость и масштабируемость благодаря секционированию на криостате, использованию атласов и рабочим процессам с контролем активности РНказы.
- Стратегическая ценность: Обоснование более точных решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go), эффективность использования капитала и снижение биологических рисков на поздних стадиях за счет изоляции специфических для конкретных регионов молекулярных ответов.
- Влияние на портфель: Приоритизация с учетом рисков и принятие решений о продвижении проектов на основе пространственно-разрешенного согласования биомаркеров.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области нейроанатомии, криостатного сечения и использования оборудования для лазерной микродиссекции захвата.
- Процесс зависит от обеспечения среды, свободной от РНказ, наличия криостата при -20°C, использования среды для оптимальной температуры резания (OCT) и систем УФ/ИК-лазеров.
- Необходима межкомандная стандартизация протоколов окрашивания, сбора срезов и загрузки колпачков между группами специалистов по нейробиологии и молекулярной биологии.
- При адаптации метода следует учитывать корректировку координат сечения относительно брегмы для различных областей мозга и моделей животных.
- Практические ограничения включают необходимость тщательного контроля загрязнения и техническое мастерство при трассировке УФ-лазером для обеспечения полного прилегания ткани.
