Измерения в естественных условиях изменения внеклеточного нейротрансмиттеров в ходе естественно награждение поведения в женских сирийских хомяков

Общая цель этой экспериментальной процедуры состоит в том, чтобы измерить высвобождение нейротрансмиттеров у бодрствующих животных. Несмотря на то, что это видео демонстрирует применение в поведенческой нейронауке с возможностью охарактеризовать высвобождение специфических нейротрансмиттеров в связи с конкретными поведенческими событиями, этот метод может быть использован во множестве других дисциплин нейронауки, таких как инъекции наркотиков. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет измерять высвобождение нейротрансмиттеров in vivo практически в реальном времени.

Начните с введения 500 микрограммов прогестерона в 0,1 миллилитра хлопкового масла подкожно за четыре часа до введения самцу, чтобы вызвать сексуальную восприимчивость. Обязательно проверяйте каждое животное в начале темной фазы его суточного цикла, так как социальное поведение грызунов подвержено изменениям в условиях тестирования белого и красного света. Сделайте калибровочные растворы свежими в день тестирования в стеклянных центрифужных пробирках объемом 20 миллилитров.

Для раствора аналита растворите 7,4 миллиграмма L-глутаминовой кислоты в 10 миллилитрах ультрачистой воды, осторожно перевернув трубку. Затем приготовьте интерференционный раствор, растворив 176,1 миллиграмма АК в 10 миллилитрах ультрачистой воды. Настройте калибровку, поместив магнитную мешалку на основание базового лабораторного кольцевого стенда.

Поместите стакан с оболочкой объемом 20 миллилитров на верхнюю часть магнитной мешалки и закрепите его на месте с помощью среднего двухконтактного зажима. Подключите стакан с оболочкой к циркуляционной водяной бане, чтобы нагреть буферный раствор до 37 градусов Цельсия. Добавьте магнитную мешалку и 20 миллилитров 100 миллимолярного фосфатного буферного раствора или PBS в стакан с оболочкой.

Затем поместите держатель для калибровки датчика на верхнюю часть стакана с оболочкой и установите сверху четырехканальный калибровочный предусилитель, закрепив его на месте с помощью прямоугольного зажима. Затем подключите предусилитель к устройству обработки и сбора данных для записи данных калибровки. Проверьте чувствительность каждого ферментативного биосенсора к глутамату перед экспериментальной регистрацией, поместив зонд в калибровочный держатель, поверх стакана с оболочкой, погрузив чувствительную полость и некоторую часть контрольного провода хлорида серебра в буферный раствор.

Инициируйте новую запись в интерфейсе компьютера с помощью бесплатного загружаемого программного обеспечения для сбора данных. Затем подключите каждый тестируемый датчик к порту четырехканального калибровочного предусилителя. Дайте датчикам достичь стабильного базового уровня.

Начните добавлять инъекции аналита, когда датчики достигнут стабильного базового уровня. Используйте отверстие в калибровочном держателе для введения наконечника пипетки в буферный раствор. Затем используйте инструмент быстрого аннотирования клавиш в программном обеспечении для записи, чтобы аннотировать время выполнения инъекции.

Далее сделайте 10 микромолярных инъекций глутамата путем пипетирования 40 микролитров раствора анализируемого вещества в буферный раствор. Подождите, пока датчик стабилизируется между добавлениями. Затем добавьте три инъекции раствора аналита, прежде чем добавить одну инъекцию из интерферентного раствора АА.

Выстелите испытательную камеру подстилкой, взятой из домашней клетки животного. Снимите окклюзионный обдуратор с направляющей канюли и вставьте либо электрод из углеродного волокна, либо ферментативный зонд через направляющий вал. Подключите датчик к записывающей системе.

Затем стабилизируйте подключение датчика, прикрутив крепление к головке крепление штифта. Затем поместите животное в испытательную камеру. Начните запись видео и заблокированного по времени амперометрического сигнала в программе.

Позвольте датчику уравновеситься в мозге перед экспериментальным тестированием. Затем введите стимул мужского пола в испытательную камеру. После первого монтажа с введением пениса самцом-стимулом, продолжайте запись еще от 10 до 30 минут, в зависимости от целей эксперимента.

Наконец, после поведенческого тестирования, отключите датчик типа «самка». Извлеките обоих хомяков из тестовой камеры, а также подстилку, чтобы очистить камеру с использованием 70% этанола. Начните с просмотра и аннотирования видео с помощью бесплатного коммерчески загружаемого программного обеспечения в замедленной съемке, чтобы точно запрограммировать поведение, привязанное по времени к амперометрическому сигналу.

Аннотируйте начало лордоза в кадре, когда самка инициирует тыльное сгибание спины, и отклоняет хвост вверх. Аннотируйте конечный лордоз, когда самка прекращает эту позу, что часто происходит, когда самка приспосабливается к другому месту в испытательной камере. Затем аннотируйте Start AI, когда самка находится в позе лордоза, а самец перемещает свою морду к аногенитальной области самки, где может произойти обнюхивание, облизывание или поглаживание ее промежностной области.

Аннотируйте конец AI, когда самец удаляет свою морду в непосредственной близости от аногенитальной области самки. Затем аннотируйте Start Mount, когда самец приближается и ставит свои передние лапы на самку в позе для верховой езды, независимо от ориентации попытки посадки. Точно так же аннотируйте Начать интромиссию при успешном толчке получает установленный мужской пенис доступ к влагалищу самки.

Когда это применимо, аннотируйте эякулят, который можно заметить по движению задней ногой самца. Наконец, аннотируйте End Intromission и End Mount одновременно в кадре, когда самец убрал две передние лапы и, таким образом, не имеет контакта с самкой. Из-за частой невозможности визуализировать его выбывание, одновременно закодируйте эти два поведения, чтобы обеспечить согласованность и надежность во время брачных боев.

На вкладке «Файл» выберите функцию «Экспорт» и выберите вкладку «TSV», чтобы сохранить измерения напряжения в виде файла расширения TSV. Откройте каждый файл с помощью программы для работы с электронными таблицами и сохраните как XLS/XLSX. Наконец, вручную добавьте аннотации для начала предбрачного боя лордоза одновременно с началом поведения лордоза, которое также включает поведение маунта, а также в начале нового брачного боя, если самка остается в позе лордоза.

Во время брачных приступов дофаминергическая быстротечность в ядре возникает во время вагинального введения или антракта самцом. Аналогичная картина наблюдалась и у других животных в отношении высвобождения глутамата. С быстрыми мимолетными свойствами, которые соответствуют индивидуальным промежуткам в дорсальном ядре прилежащего ядра во время копулятивного приступа.

После освоения эта методика, не считая подготовительных стеротактических операций, может быть выполнена за один день. При выполнении этой процедуры важно убедиться в работоспособности каждого датчика. Несмотря на то, что в этом видео показана запись с помощью одного пробника, этот подход может быть расширен до одновременной двойной записи.

Но это добавляет слой сложности, который не является тривиальным. Это видео демонстрируется в условиях освещения для удобства видимости. Однако мы проводим наши поведенческие эксперименты в темных условиях, и этот параметр может быть изменен в зависимости от конкретных экспериментальных потребностей.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как последующий гистологический анализ срезов мозга, чтобы определить и подтвердить точное размещение датчика. Кроме того, дальнейший анализ данных с использованием закодированных поведенческих данных может быть выполнен в отношении любых параметров, представляющих интерес. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области нейробиологии к изучению высвобождения нейротрансмиттеров, в том числе неэлектроактивных нейротрансмиттеров, таких как глутамат, практически в реальном времени у бодрствующих животных.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как калибровать глутаматергические зонды, имплантировать зонды, провести поведенческий эксперимент по измерению изменений в высвобождении нейротрансмиттеров в различные компоненты поведения и закодировать эти данные для последующего анализа. Не забывайте, что при работе с живыми животными следует внимательно относиться к их комфорту и общему благополучию, чтобы обеспечить наилучшие результаты для вас и животных.