Завод промоутер анализ: Определение и характеристика корень конкреций конкретной промоутера в общей бин

Волосистые корни используются для получения трансформированных корней у Phaseolus с помощью репортерной конструкции. Полученные трансгенные корни используются для изучения экспрессии репортерного гена. Исследования экспрессии промоторов имеют решающее значение для понимания пространственно-временных паттернов экспрессии генов.

Сегодня мы продемонстрируем методики индукции волосистых корней и изучим паттерны экспрессии промоторов в трансгенных волосистых корнях в симбиотических условиях корневых клубеньков у Phaseolus. Эстрада-Наваррете и его коллеги ранее установили индуцированную волосистую корневую систему Agrobacterium rhizogenes у Phaseolus. Нынешний метод поможет ускорить продолжительность индукции волосистого корня и тем самым повысить универсальность системы.

Демонстрировать процедуры будут мой коллега Манодж-Кумар Артикала и студенты бакалавриата Альма Летиция и Бренда Мариана из моей лаборатории. Для начала выполните поиск последовательности гена NIN в базе данных генома Phaseolus vulgaris от Phytozome и выберите необходимую длину последовательности до ATG. Спроектируйте олигонуклеотиды после соответствующего анализа промоторных последовательностей.

Свежеприготовленная геномная ДНК Phaseolus будет служить матрицей для ПЦР-амплификации промоторной последовательности. Приготовьте мастер-смесь для ПЦР с высокоточной Taq-полимеразой и стандартными компонентами ПЦР, а также предварительно разработанными олигонуклеотидами. Аликвотируйте мастер-смесь в ПЦР-пробирки объемом 2 мл, и проведите амплификацию промоторного фрагмента в термоамплификаторе и с подходящей программой.

Отделение продукта ПЦР электрофоретически на 1,2%-ном агарозном геле. Визуализируйте фрагмент НИН, усиленный на 700 парах оснований под действием УФ-излучения. Вырезаем, элюируем и клонируем фрагмент в вектор входа Gateway pENTR/D-TOPO в соответствии со стандартной инструкцией.

Преобразуйте два микролитра реакционной смеси в компетентные клетки E.coli при температуре 42 градуса Цельсия в течение 50 секунд и поместите трансформированную E.coli на LB с добавлением 50 мг на литр канамицина. Выращивайте пластинчатые клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи. Проведите реакцию ПЦР для плазмид, выделенных из случайно выбранных колоний E.coli с использованием олигонуклеотидов M13.

Фрагмент на 1024 парах оснований должен указывать на положительные клоны. Выполните реакцию LR между клоном положительного входа и двоичным вектором назначения. Преобразуйте два микролитра реакционной смеси в кишечную палочку и выберите колонии по 100 мг на литр спектиномицина при температуре 37 градусов Цельсия.

Амплифицируйте плазмиды NIN-специфичными олигонуклеотидами. Положительный клон должен амплифицироваться при 700 парах оснований. Секвенирование и проверка правильности фрагмента клона.

Мобилизуйте конструкцию-промотор NIN в электрокомпетентные клетки K599 Agrobacterium rhizogenes. И еще раз подтвердить клон с промотор-специфичными олигонуклеотидами. Серой стерилизуйте семена Phaseolus vulgaris и проращивайте на стерильной, влажной фильтровальной бумаге в течение двух дней в темноте при температуре 28 градусов по Цельсию.

Распределите 150 микролитров клеток Agrobacterium rhizogenes с конструкцией NIN и контрольным вектором на планшеты LB с селекцией спектиномицина. Выращивайте культуру на ночь при температуре 28 градусов по Цельсию. Снимите покрытие с рассады Phaseolus и соскребите клетки Agrobacterium rhizogenes с помощью изогнутого кончика объемом 200 микролитров с пластины.

И ресуспендируйте в пробирку Eppendorf с одним мл стерильной дистиллированной воды. Соберите клетки Agrobacterium rhizogenes в шприц объемом три мл и поместите рассаду Phaseolus в заранее подготовленную пробирку. Слегка проколите кончиком иглы гипокотиль пророщенных семян, одновременно вводя клетки Agrobacterium rhizogenes.

Следует следить за тем, чтобы игла не проходила через гипокотиль. Поддерживайте введенную рассаду в камере роста при температуре 28 градусов Цельсия с 16 часами света и 8 часами темного фотопериода. Мозоли на раненых гипокотилах должны быть видны к пяти-семи дням.

Через две недели удалите первичный корень, срезав стебель на два сантиметра ниже волосистых корней, и пересадите их в горшки, содержащие стерильный вермикулит. Одновременно инокулируйте растения одним мл Rhizobium tropici, чтобы вызвать клубеньковость. Обязательно разведите культуру Rhizobium до 6 при наружном диаметре 600.

Поддерживайте растения в камере роста при температуре 28 градусов Цельсия, 16 часов света и восьми часов темного фотопериода, а также орошайте раствором B и D. Для изучения пространственно-временных паттернов экспрессии промотора NIN выборка проводится в разные моменты времени. Выньте растения, не повреждая корней, и промойте корни без каких-либо пятнышек вермикулита.

Случайным образом выберите корни из NIN и контрольных растений и приступайте к гистохимическому окрашиванию GUS, инкубируя образцы в буфере для анализа GUS при температуре 37 градусов Цельсия в течение 16 часов в темноте. Наблюдайте за окрашенными GUS корнями под стерео и составным микроскопом. На этом рисунке показана индуцированная Rhizobium экспрессия промотора NIN в первичных корнях.

Экспрессия промотора NIN также может наблюдаться в инфицированных Rhizobium корневых волосковых клетках. Кроме того, экспрессия GUS может быть задокументирована на разных стадиях развития корневого клубенька. В корнях контроля вектора не наблюдалось экспрессии ГАС.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее представление о разработке конструкций промотора и изучении паттернов экспрессии промотора в трансгенных волосатых корнях Phaseolus. Эта система может быть расширена для изучения паттернов экспрессии промоторов при других симбиотических и патогенных взаимодействиях у Phaseolus, а также у других эвдикотов.