Трехмерная реконструкция сосудистой архитектуры пассивной очистили ЯСНОСТИ мыши яичника

Общая цель этого протокола состоит в том, чтобы получить полное трехмерное представление о распределении капилляров в фолликулах яичников мышей и показать их взаимосвязь. Яичники являются важным органом в репродукции и эндокринологии. Подсчитайте каждую стадию развития фолликула и соматических клеток.

Кроме того, в отличие от других органов, яичник не демонстрирует повторяющегося разветвления функциональной единицы. Местная сосудистая система может быть вместе с нервной системой также способны претерпевать серьезные изменения в каждом менструальном цикле у взрослых женщин. Применение пассивной прозрачности в яичнике позволяет нам увидеть общее распределение и связь между клетками и фолликулами в яичнике.

Ключевым моментом этого показателя является то, что он оказывает наименьшее влияние на яичники и отвечает за очистку от различных маркеров. Путем реконструкции микроскопического изображения мы получили карту яичника. Можно отчетливо наблюдать некоторые детали сосудов, нейронов и фолликулов.

Для анализа изображений были использованы некоторые варианты Имариса, чтобы оценить взаимосвязь между яичником и структурами. Приготовьте обильные растворы в соответствии с инструкцией к артикулу и держите их на льду. Обезболите мышей и убедитесь, что мышь не реагирует на защемление пальцев ног.

Распылите этанол, сделайте надрез на правом предсердии, затем мгновенно пропитайте левый желудочек 20мл ледяного PBS со скоростью 10мл в минуту для вымывания крови. Затем пропитайте животное холодным гидрогелевым раствором с той же скоростью. Соберите яичники, а также матку, чтобы сохранить целостность морфологии яичников.

Перенесите отделенные яичники в холодный раствор гидрогеля. Под стереомикроскопом удаляют жировые ткани вокруг яичника. Для лучшего результата фиксации тканей мы рекомендуем удалить яичниковую сумку.

Держите яичники в гидрогелевом растворе в течение трех дней. Через три дня переложите яичники в стеклянную пробирку и заполните пробирку свежим раствором гидрогеля. Натяните парапленку на верхнюю часть трубки, а затем оберните другую парапленку вокруг горлышка трубки.

Убедитесь, что между парапленкой и гидрогелевым раствором нет пузырьков. Поместите стеклянную трубку в шейкер при температуре 37 градусов по Цельсию на два часа, пока не образуется гель. Аккуратно удалите излишки геля вокруг яичников с помощью бумажного фильтра.

Поместите яичники в пробирку объемом 15 мл и заполните пробирку 10 мл очищающего раствора. Поместите пробирку в шейкер при температуре 37 градусов по Цельсию не менее чем на два месяца. Меняйте раствор для очищения каждый день в течение первых трех дней, а затем еженедельно до тех пор, пока яичник не очистится.

Все процедуры иммуноокрашивания проводятся при температуре 37 градусов по Цельсию на шейкере. Сначала промойте яичник в PBST в течение 24 часов. Второй инкубированный яичник в первичные антитела, разведенные PBST в течение двух суток.

В-третьих, смойте первичные антитела PBST-буфером. В-четвертых, инкубируйте яичник с желаемым вторичным антителом в PBST в течение двух дней. В-пятых, смыть вторичные антитела с помощью PBST.

В-шестых, перенесите яичник в раствор для согласования показателей преломления для гомогенизации RI. Проверьте визуальную прозрачность, когда яичник полностью осветлился, его можно визуализировать. Для начала приготовьте чистое блюдо со стеклянным дном.

Сделайте цилиндр для шпаклевки и придайте ему форму подковы. Плотно прижмите внешний край к предметному стеколу, чтобы создать герметичное пространство. Высота шпаклевки должна быть немного выше завязи.

Осторожно переместите завязь к центру и добавьте монтажный раствор. Надавите на замазку блюдом и закрепите ее двумя кусками шпаклевки. Когда яичник готов к изображению, для его изображения можно выбрать конфокальный микроскоп Nikon с объективом 16X.

Для получения изображений с помощью конфокального микроскопа сначала выберите линзу на панели Ni-E. В панели захвата выберите количество каналов. Во-первых, используйте язычок Eye Port и джойстик контроллера XY, чтобы переместить ткань к центру поля зрения с помощью окуляров микроскопа.

Во-вторых, после выключения света затвора нажмите на вкладку «Трансляция», чтобы отрегулировать мощность лазера, HV и смещение для каждого канала. На панели Коррекция интенсивности по оси Z отрегулируйте сбор данных для верхнего слоя, нажмите кнопку с плюсом, чтобы определить верх, переместите линзу вниз и установите соответствующую мощность высоковольтного и лазерного излучения на нижнюю часть ткани, а также добавьте информацию о самом низком слое, нажмите кнопку To ND, чтобы синхронизировать настройку с панелью и сбором. И при получении сначала установите количество шагов сканирования.

Нажмите на вкладки Z и большое изображение. Во-вторых, перейдите в окно сканирования большого изображения, чтобы определить размер поля в соответствии с границей ткани. В-третьих, вернитесь к получению ND, чтобы ввести размер полей сканирования и выбрать перекрытие в пределах 10 и 50%, затем нажмите «Запустить коррекцию Z» и дождитесь процесса визуализации.

Сначала используйте imagic, чтобы открыть исходный файл NIS. Нажмите кнопку изображения, выберите цвет и каналы отображения, затем нажмите файл, выберите последовательности изображений и отдельно сохраните их как файлы TIFF. Во-вторых, используйте Imaris для открытия одного из файлов tiff.

Нажмите кнопку редактирования и выберите добавить каналы, чтобы добавить остальные. Название и цвет можно изменить в настройках дисплея. Толщина ткани также должна быть скорректирована в свойствах изображения.

В-третьих, нажмите кнопку редактирования и выберите «Обрезать 3D», чтобы вырезать лишнюю деталь. Сначала нажмите кнопку с нитью накала и нажмите далее. Перейдите на панель среза, найдите сосуд для трассировки и расстояние, затем вернитесь к Surpass, введите статическое значение и нажмите далее.

Во-вторых, отрегулируйте начальный порог и порог заданной точки. На панели камеры выберите выделение, нажмите Shift и нажмите на точку, чтобы удалить лишнюю деталь. В-третьих, выберите самый высокий порог и нажмите «Далее».

Не выделяйте точки обнаружения и переходите дальше. Некоторую лишнюю деталь можно удалить в панели редактирования. Цвет можно редактировать, щелкнув по цвету.

3D-архитектура сосудистой сети яичников была исследована после иммуноокрашивания CD31. 3D-структуру можно наблюдать либо срезами через другие срезы, либо целиком с помощью объемного рендеринга. CD 31 – окрашивание фолликулярной сосудистой сети взрослой мыши.

С помощью реконструкции капилляров филаментами мы смогли показать взаимосвязь между отдельными фолликулами и их капиллярами. Яичник, как и у женщины, всегда активен и взаимозаменяем. Однако из-за ограниченности традиционного гистологического анализа очень трудно описать взаимоотношения между такими сложными составляющими.

Недавно разработанный метод, пассивная ясность, может помочь нам преодолеть оптическое препятствие, сохранить целостность целых тканей и предоставить функциональные подсказки.