Синтез инфекционных бактериофагов в E. coli-на основе свободных клеток выражение системы

Общая цель этого эксперимента — описать, как бактериофаги синтезируются из своего генома с использованием системы трансляции транскрипции, полностью состоящей из E.coli. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области синтетической биологии, такие как выяснение механизмов молекулярной самосборки в живых системах. Главным преимуществом данной техники является универсальность платформы.

Многие биологические системы могут быть полностью воспроизведены и точно настроены для экспериментального анализа. Начните эту процедуру с препарирования фаговых бляшек, как описано в текстовом протоколе. Используйте конец стерильной пастеровской пипетки для сердцевины и удалите одну бляшку.

Продуйте налет в разведенные клетки. Затем выдерживают при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух часов. Чтобы проверить на полное заражение, возьмите образец объемом 500 микролитров в пробирку объемом 1,5 миллилитра и добавьте 10 микролитров хлороформа.

смесь на высокую скорость и понаблюдайте, не уточняется ли раствор, что свидетельствует о фаговой инфекции. Как только клетки будут полностью инфицированы, инкубируйте еще два часа. Затем добавьте ДНКазу перед центрифугированием клеток при 8000 g и четырех градусах Цельсия.

Выбросьте надосадочную жидкость, затем повторно суспендируйте гранулу в 10 миллилитрах 1X Трис хлорида магния. Добавьте 500 микролитров хлороформа и вортекс на высокой скорости для лизирования клеток. Осветлить центрифугированием при 12 000 умноженных на g в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия.

Затем поместите надосадочную жидкость в коническую пробирку объемом 15 миллилитров и храните при температуре четыре градуса Цельсия. Приготовьте четыре градиента от пяти до 45% сахарозы, пипетируя 2,5 мл 45% сахарозы в четыре ультрацентрифужные пробирки. Сверху на слой налейте примерно 2,6 миллилитра 5%-ной сахарозы, останавливая, когда жидкость достигнет двух миллиметров от края тюбика.

Смешайте градиенты вращением наклонной трубки с помощью инструмента для формирования градиента в течение 43 секунд при 86 градусах и 23 оборотах в минуту. С помощью пипетки объемом в один миллилитр добавьте 500 микролитров объединенной фаговой суспензии, доводя наконечник до поверхности жидкости и очень медленно распределяя объем на верхнюю часть градиента сахарозы, стараясь не перемешать с помощью быстрого пипетирования. Центрифугируйте при 70 000 умноженных на g в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия.

Погрузите тупую канюлю в раствор до тех пор, пока кончик не окажется по центру самого верхнего края фаговой ленты. Снимите бандаж, проводя по поршню шприца, пока большая часть фагового бандажа не будет удалена. Затем добавьте объем сахарозы со взвешенным фагом в три или четыре ультрацентрифужные пробирки.

Заполните пробирки на расстоянии трех-четырех миллиметров от верхней части пробирки холодным 1XTM. Накройте трубочки парафиновой пленкой и переверните для перемешивания. Поместите пробирки обратно в ультрацентрифугу и выдерживайте при 145 000 раз g в течение одного часа при четырех градусах Цельсия.

Быстро слейте надосадочную жидкость и слейте вниз головой на одноразовые салфетки. Разделите от 200 до 400 микролитров холодного 1XTM на все гранулы и снова суспензируйте на ночь при температуре четыре градуса Цельсия. Встряхивание не требуется.

За день до внесения титров приготовьте культуру клеток-хозяев E.coli в 10 миллилитрах питательной среды LB и оставьте культуру в встряхивающем инкубаторе, установленном на 250 об/мин и 37 градусов Цельсия, на ночь. Затем приготовьте мастер-смесь, набрав 5,25 миллилитров топ-агара, 220 микролитров разведенных образцов фагов и 50 микролитров бактериальных клеток хозяина в пробирку для культуры объемом 14 миллилитров. Закупорьте культуральную пробирку и затвор на высокой скорости.

Достаньте две культуральные пластины из инкубатора с температурой 37 градусов Цельсия. Затем медленно добавьте 2,5 миллилитра мастер-микса в центр первой тарелки. Осторожно поворачивайте пластину вручную, чтобы равномерно распределить основную смесь так, чтобы она охватывала всю тарелку для культуры.

Подождите 20 минут, чтобы убедиться в застывании верхнего агара. Инкубируйте пластины при температуре 37 градусов Цельсия в течение четырех-семи часов. Подсчитайте бляшки и определите концентрацию фагов для каждого образца реакции.

Разбавьте порцию фагового запаса до 400 микролитров с помощью буфера 1XTM в свежей пробирке объемом 1,5 миллилитров. Добавьте в разбавление равный объем трисфенолхлороформа. Аккуратно встряхните смесь на лабораторной качалке или вручную в течение пяти минут.

Затем центрифугируйте полученную эмульсию при 17 000 умноженных на g в настольной центрифуге в течение 5-10 минут. Удалите верхнюю водную фазу в новую трубку, стараясь не нарушить межфазную границу. Повторите эти действия еще два раза, чтобы получить в общей сложности три экстракции фенола.

Переложите водную фазу в свежую пробирку и добавьте равный объем хлороформа. Встряхните и центрифугируйте перед тем, как перенести водный образец ДНК в чистую пробирку. Далее добавьте 0,4 объема трех моляров ацетата натрия и три объема 95% этанола.

Поместите трубку в морозильную камеру с температурой минус 20 градусов Цельсия для выпадения осадков на ночь. Центрифугируйте при 17 000 раз g в настольной центрифуге в течение 10-15 минут. Удалите и выбросьте надосадочную жидкость путем сцеживания или пипетирования.

Затем добавьте 500 микролитров 70% этанола и осторожно встряхивайте трубку, пока гранула не освободится от дна трубки. После центрифугирования удалите и выбросьте этанол, стараясь не потревожить гранулы. После добавления этанола и центрифугирования, как и раньше, удалите и выбросьте этанол во второй раз, еще раз стараясь не потревожить гранулы.

Высушите пеллеты на воздухе на столе в течение 30-60 минут. После высыхания добавьте в гранулу 50 микролитров воды двойной дистилляции и выдерживайте в течение часа при комнатной температуре или в течение ночи при четырех градусах Цельсия для повторного взвешивания. Определите концентрацию ДНК с помощью измерений поглощения на 280 нанометрах.

Чтобы провести бесклеточную реакцию, необходимо аликвотировать указанный объем сырого экстракта, 33% от конечного объема реакции, в микроцентрифужную пробирку. Подготовьте мастер-микс, как указано в текстовом протоколе. Добавьте соответствующий объем каждого компонента в сырой экстракт.

После добавления последнего компонента гомогенизируйте реакцию путем вортексирования. Затем разделите основную смесь на n микроцентрифужных пробирок. Далее добавим указанные объемы переменных компонентов в массив мастер-микса.

Добавляйте воду в каждую реакцию, чтобы достичь желаемого конечного объема реакции перед вортексом. Затем инкубируйте микроцентрифужные пробирки при температуре 29 градусов Цельсия в течение не менее восьми часов или в течение ночи. После подготовки клеток к титру фагов, как описано в текстовом протоколе, титруйте окончательный бесклеточный раствор реакции LB, как было показано ранее в этом видео.

Здесь представлены репрезентативные результаты бесклеточной реакции синтеза фага phi X 174. Эта фаговая бляшка демонстрирует успешную фаговую реакцию, которая была титрованной при соответствующем разведении, что видно по подсчетному количеству бляшек. Тем не менее, успешная реакция может плохо проявиться, если коэффициент разбавления слишком низок для фагового выхода реакции.

На этой табличке изображено неисчислимое количество бляшек. Здесь показана пластина с неоднородным распределением фаговых бляшек из-за недостаточного предварительного уравновешивания температуры культурального планшета. Во время титра фагов культуральная пластина затвердевала в правой нижней части планшета.

Условия молекулярной скученности оказывают сильное влияние на синтез фагов для phi X 174 и, T7.In частности, выход фага для T7 падает на три порядка, когда концентрации ПЭГ падают с 4 до 2% по объему. После освоения фаговая очистка и экстракция ДНК могут быть проведены за два дня, если они выполнены правильно. Бесклеточная реакция занимает всего несколько часов, когда проблем нет.

После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как выращивать фаги, извлекать и очищать их ДНК, а также использовать результат для восстановления полностью инфицированного фага с помощью бесклеточной реакционной системы. Работа с фенолом может быть чрезвычайно опасной, поэтому во время выполнения этой процедуры следует надевать такие меры предосторожности, как лабораторный халат, защита глаз и перчатки. Все работы с открытыми емкостями с фенолом следует выполнять в вытяжном шкафу.