Интеграция свободной деривации индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток с использованием матрицы Laminin 521

Общая цель этого протокола заключается в получении однородных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека. Этот метод может быть использован для получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека для многих целей, включая моделирование заболеваний, скрининг лекарств или получение клеток для доклинических испытаний клеточной терапии. Преимущество этого протокола заключается в том, что он надежен и генерирует однородные клетки, которые поддерживаются в удобной для пользователя, не содержащей ксеносов и полностью химически определенной культуральной системе.

Поскольку человеческие iPS-клетки повторяют генетический фон донорской ткани и потенциально могут быть дифференцированы в любой тип клеток, связанных с заболеванием, они предоставляют отличные инструменты для моделирования диссертаций. Биопсия, диссекция и забор колонии являются сложными процедурами. Наблюдение за их выполнением опытными руками помогает понять процедуры и облегчает их повторение.

Сегодня эту процедуру продемонстрируют Гарриет РоннХолм и Келли Дэй, два высококвалифицированных лаборанта из iPS Core Facility в Каролинском институте. Образцы биопсии кожи могут храниться в PBS плюс 1% пенициллина стрептомицина до 48 часов при четырех градусах Цельсия, но должны быть обработаны как можно быстрее после получения. Перенесите биопсию в 35-миллиметровую чашку.

Погрузите биопсию кожи в 35-миллиметровую чашку с двумя миллилитрами 70% этанола на 30 секунд. Добавьте один миллилитр стерильного раствора сбалансированной соли Хэнка с добавлением 1% пенициллина стрептомицина в новую 35-миллиметровую чашку и перенесите биопсию в новую чашку. Перенесите биопсию в четыре 35-миллиметровые чашки, заполненные одним миллилитром свежеприготовленного 0,1%-ного раствора.

С помощью стерильных хирургических скальпелей и щипцов разрежьте биопсию кожи на один-два кубических миллиметра. Переложите кусочки биопсии с раствором диспазы в пробирку объемом 15 миллилитров и добавьте еще два миллилитра диспазы. Ополосните 35-миллиметровую посуду одним миллилитром раствора и перелейте промытый раствор в 15-миллилитровую трубку.

Инкубируйте биопсию при четырех градусах Цельсия в течение ночи. На следующее утро добавьте четыре миллилитра 0,1% коллагеназы I в пробирку с кусочками биопсии и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение четырех часов. За тридцать минут до посева клеток покройте одну лунку в шестилуночной тканевой культуральной тарелке одним миллилитром 0,1% желатина в DPBS.

Выдерживать при комнатной температуре в течение 30 минут. После четырехчасовой инкубации с коллагеназой центрифугируйте переваренные клетки в 300 раз g в течение трех минут при комнатной температуре. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте перевар в двух миллилитрах среды фибробластов.

Удалите желатиновый раствор из заранее подготовленной шестилуночной тканевой культуральной пластины. Перенесите клеточную суспензию вместе с оставшимися кусочками ткани на шестилуночный планшет. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в условиях высокой влажности.

Фибробласты готовы к прохождению в колбу для культуры тканей T25 после конфлюентности на 80%. Фибробласты со второго по четвертый проходы оптимальны для перепрограммирования, поскольку эффективность перепрограммирования обычно выше для фибробластов с нижним проходом. Отсадите питательную среду из колбы и промойте клетки одним миллилитром DPBS.

Аспирируйте DPBS и добавьте один миллилитр 0,5% трипсина ЭДТА. Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут или до тех пор, пока клетки не отделятся. Добавьте два миллилитра фибробластной среды, ресуспендируйте клетки и перенесите клеточную суспензию в 15-миллилитровую пробирку.

Центрифугируйте при 300 умноженных на г в течение трех минут при комнатной температуре. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в двух миллилитрах среды фибробластов. После подсчета фибробластов с помощью гемацитометра засемените пять умножить на 10 до 4 клеток в одну лунку 24-луночного планшета для культивирования тканей.

Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия на ночь. На следующий день, поскольку вирус Сендай будет обработан, продолжайте процедуру в специальной лаборатории BSL-2, используя соответствующие средства индивидуальной защиты. Аспирируйте среду для культивирования клеток и добавьте 250 микролитров раствора вируса Сендай.

Инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов по Цельсию. За день до сбора колоний подготовьте 24-луночные планшеты для культивирования тканей, покрытые LN-521. Пипеткой нанесите 250 микролитров раствора LN-521 в одну лунку 24-луночного планшета.

Запечатайте пластину с помощью парапленки и выдерживайте при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи. На следующий день отсадите раствор LN-521 из одной лунки 24-луночного планшета и добавьте в лунку 500 микролитров E8. Использование сетки для волос и процедурной маски рекомендуется при сборе колоний под стереомикроскопом.

Колонии готовы к сбору, когда они достигают размера более одного миллиметра в диаметре, имеют острые края и растут однородными монослоями. Не стоит подбирать колонии с нечеткими границами и большими некомпактными гетерогенными клеточными массами. Разрежьте каждую колонию скальпелем на более мелкие кусочки в виде сетки.

С помощью пипетки объемом 200 микролитров механически соскребите клеточные листы с чашки, а затем перенесите лист в лунку 24-луночного планшета для культуры тканей, предварительно покрытого LN-521. Отбор колоний имеет решающее значение для успеха этого протокола. Выбор нескольких дополнительных колоний обеспечит прикрепление в достаточном количестве.

Дайте элементам прикрепиться без смены среды E8 в течение 48 часов. Ферментативно пропускают клетки, когда колонии достигнут размера более пяти миллиметров. Отсадите питательную среду из клеток и промойте 250 микролитрами DPBS.

Аспирируйте DPBS и добавьте 250 микролитров диссоциационного реагента. Выдерживайте при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех минут. Обратите внимание, что клетки начали округляться вверх.

Отделите клетки от планшета, промыв клетки диссоциативным реагентом. Добавьте 500 микролитров среды Е8 в 15-миллилитровую пробирку и перенесите клетки и диссоциационный реагент в пробирку. Центрифугируйте при 300 умноженных на g в течение трех минут.

Отсадите надосадочную жидкость из 15-миллилитровой пробирки и ресуспендируйте клеточную гранулу в 500 микролитрах среды Е8. Подсчитайте клетки с помощью гемацитометра и засемените от 2,5 до 5 умножить на 10 до 4 клеток в другую предварительно приготовленную лунку с покрытием LN-521, содержащую 500 микролитров среды Е8 комнатной температуры. Добавьте ингибитор ROCK до конечной концентрации 10 микромоляров.

Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия. Используя этот протокол, индуцированные плюрипотентными колониями стволовых клеток человека появляются из трансдуцированных фибробластов примерно на 12-й день после трансдукции. Колонии были готовы к сбору примерно через три-четыре недели после трансдукции.

Предпочтительными особенностями являются уплощенные компактные клеточные массы, рост в виде однородных монослоев и острые края. Эти изображения яркого поля показывают ранний пассаж гомогенной полностью перепрограммированной iPS-клеточной линии человека по сравнению с высокогетерогенной клеточной линией. Потеря вирусного вектора Сендай была подтверждена отсутствием специфичных для вируса Сендай вектор-маркеров в клетках iPS человека на 12 пассаже в отличие от человеческих iPS клеток на 3 пассаже.

Иммуноцитохимическое окрашивание полученных клеток на маркеры плюрипотентности OCT4, SSEA-4 и NANOG дало однородно положительный результат. Экспрессия мРНК эндогенных генов плюрипотентности была показана методом ПЦР с обратной транскриптазой. Клеточные культуры, содержащие частично перепрограммированные клетки, которые не экспрессировали факторы плюрипотентности, были отброшены.

Дифференцировочный потенциал iPS-клеток человека оценивали по образованию эмбриоидных телец. С помощью ПЦР в реальном времени после 21 дня дифференцировки эмбриоидных тел была обнаружена экспрессия мРНК маркеров, специфичных для энтодермы, мезодермы и эктодермы, что подтвердило, что полученные iPS-клетки человека способны к дифференцировке в три зародышевых слоя. После освоения этой техники можно заниматься около 22 часов в течение примерно 16 недель.

Полученные индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека могут быть дифференцированы в любой тип клеток взрослого человеческого организма, чтобы ответить на любые вопросы, относящиеся к вашей области исследований. Мы надеемся, что после просмотра этого видео у вас будет хорошее понимание того, как выполнять шаги, необходимые для получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из биопсии кожи.