Электрофизиологическая запись из Drosophila Trichoid Sensilla в ответ на одоранты низкой летучести

Общая цель этой методики состоит в том, чтобы эффективно представлять пахучие вещества с низкой летучестью нейронам обонятельных рецепторов и дрозофилам для электрофизиологической регистрации. Эти нейроны расположены в трихоидной сенсилле и реагируют на длинноцепочечные кутикулярные феромоны. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области коммуникации феромонов насекомых, обеспечивая улучшенную технику доставки запаха.

Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет эффективно представить запахи, которые ранее были недоступны из-за их низкой летучести, во время записи in vivo. В частности, феромоны подаются с близкого расстояния, что имитирует расстояние между ухаживающими самцами и самками-мишенями. Подготовка компонента картриджа для подачи запаха для записи AT4 начинается с удаления 0,9 сантиметра с узкого конца наконечника пипетки объемом 200 микролитров.

Затем со второго наконечника пипетки снимите 1,7 сантиметра с узкого конца, и 1,5 сантиметра с широкого конца, чтобы получилась длина 1,8 сантиметра. Затем с помощью щипцов поместите диск фильтровальной бумаги диаметром 1/8 дюйма на кончик участка диаметром 1,8 сантиметра. Оставьте небольшое отверстие, через которое может проходить воздух.

Затем закрепите секции пипетки вместе с меньшим участком под углом вниз, чтобы направить их на препарат. Теперь с помощью P10 нанесите одорант в желаемом разбавлении на фильтровальную бумагу. Затем, чтобы испарить растворитель, дайте заряженным картриджам посидеть в вакуумном эксикаторе в течение часа.

Для начала соберите предметное стекло для подготовки мух. На предметное стекло прикрепите стеклянный покровный лист с пластилином, чтобы создать угол около трех градусов между предметным стеклом и покровным стеклом. Затем прикрепите двусторонний скотч в двух местах, внутренний край покровного слипа и горку сразу под покровным слипом.

Всегда используйте свежий скотч. Теперь соберите интересующую муху в аспираторную трубку. Затем наденьте наконечник для пипетки объемом 200 микролитров на конец трубки и одновременно переверните трубку во время обдувания, чтобы протолкнуть муху в конец наконечника для дозатора.

Затем с помощью бритвенного лезвия разрежьте кончик чуть ниже тела мухи. Теперь осторожно загрузите пластилин для формовки в широкий конец кончика, чтобы головка мухи протолкнулась в меньшее отверстие. Как только обе антенны обнажатся, прекратите утрамбовывать глину.

Теперь с помощью щипцов расположите препарат на предметном стекле. Расположите клипеус лицом горизонтально так, чтобы боковая сторона антенны прилегала к поверхности скольжения заклеенной крышки. Затем поместите удерживающий стержень на аристу, чтобы закрепить антенну на ленте.

Затем поместите преп на сцену установки. Убедитесь, что трихоиды видны вдоль дистального бокового края третьего сегмента антенны. Сенсилла должна иметь четкий силуэт на фоне.

Держите препарат под постоянным потоком увлажненного воздуха, подаваемым через отдельную трубку на расстоянии около двух сантиметров. Чтобы сделать запись, вставьте электрод сравнения в клипеус быстрым и плавным движением. Поместите его чуть ниже кутикулы, где он будет соприкасаться с гемолимфой.

Далее медленно опускайте записывающий электрод до тех пор, пока он не войдет в ту же плоскость обзора, что и целевой сенсиллум. Затем вставьте записывающий электрод в сенсиллярное основание. Прежде чем продолжить, убедитесь в высоком соотношении сигнал/шум с идентифицируемыми всплесками от нейронов AT4-A и AT4-C.

Нейроны AT4-A должны возбуждаться не быстрее 20 герц. Теперь подсоедините картридж к трубке подачи одоранта. Начните с контроля растворителя и переходите к максимальной концентрации одоранта.

В этом случае прилагается картридж с пальмитолеиновой кислотой. Затем с помощью микроманипулятора маневрируйте картриджем в сторону препа, направляя его на голову. Расположите наконечник картриджа так, чтобы он был направлен прямо на антенну с расстояния около четырех миллиметров.

Патрон также должен находиться примерно на один миллиметр выше затвора. Точное позиционирование картриджа относительно препарирования является самым важным этапом этой процедуры. Устойчивые нейронные реакции зависят от воспроизводимого положения картриджа в испытаниях.

Картридж может быть близко ограничен электродами и затвором. В идеале он должен находиться на расстоянии не менее четырех миллиметров от любого электрода. Для стимуляции установите регулятор расхода одоранта на 500 миллисекундных интервалов и используйте скорость потока 500 миллилитров в минуту.

Для каждого всплеска стимула записывайте электрическую активность в течение 10 секунд. После применения одоранта осторожно втяните картридж, прежде чем заменить его картриджем, содержащим следующую по величине концентрацию. После того, как вы сделаете все записи за день, тщательно промойте записывающий электрод дистиллированной водой.

С помощью описанных методов на семидневных самцах берлинских мух дикого типа сравнивали относительную эффективность транс- и цис-пальмитолеиновой кислоты. Транспальмитолеиновая кислота была более сильным стимулятором нейронов обонятельных рецепторов Or47b. От каждой мухи был зарегистрирован только один нейрон.

Расстояние между раскрытием картриджа с запахом и головой мухи оказывало существенное влияние на нейронные реакции. На расстоянии четырех миллиметров было гораздо больше шипов в ответ на пальмитолеиновую кислоту. На расстоянии 11 миллиметров практически не наблюдалось заметных реакций нейронов O47b.

Близкое представление пальмитолеиновой кислоты было весьма важным для изучения ее эффектов в качестве одоранта. Мы надеемся, что после просмотра этого видео у вас появится четкое представление о том, как вводить пальмитолеиновую кислоту или другие малолетучие запахи в нейроны обонятельных рецепторов дрозофилы во время записи in vivo одиночного сенсиллума. Как только эта техника будет освоена, запись всей кривой дозировки от одной мухи может быть достигнута примерно за 20 минут.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области обоняния насекомых к изучению нейрофизиологии и механизмов передачи сигналов для обнаружения феромонов.