Оценка плотности синапсов в срезах гиппокампа грызунов мозга

Общая цель этого протокола иммуноокрашивания — оценить плотность синапсов в срезах мозга ex vivo. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии и полезен при изучении изменений плотности синапсов, наблюдаемых при нейродегенеративных заболеваниях. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она обеспечивает полуколичественную оценку плотности синапсов, которую можно сравнить между экспериментальными условиями, подготовленными в то же время.

Начните с того, что поместите мозг мыши на чашку Петри. Затем удалите мозжечок и небольшой участок лобной коры с помощью скальпеля, прежде чем сбросить его вниз на среднюю линию мозга. Поверните одну полусферу на ту сторону, которая только что была вырезана, и приклейте ее к сцене вибратома.

Налейте ледяной ACSF в камеру для микротомов и напитайте раствор кислородом. Вырежьте участки толщиной от 200 до 300 микрон по всей интересующей вас области. Для гиппокампа должно быть получено примерно три-четыре среза на каждое полушарие.

С помощью пластиковой пастеровской пипетки переложите ломтики в камеру с регулируемой температурой, погруженную в кислород ACSF. Выдерживайте при температуре 34 градуса Цельсия в течение 30 минут. По истечении 30 минут переложите ломтики в 24-луночный планшет, содержащий 4% параформальдегида с 4% сахарозы, и зафиксируйте от 20 минут до одного часа при комнатной температуре.

После фиксации промойте ломтики три раза в 1x PBS в течение 10 минут каждый раз. Чтобы начать иммунофлуоресцентное окрашивание, замените PBS в лунках для среза блокирующим и проникающим буфером и инкубируйте при комнатной температуре в течение четырех-шести часов на шейкере. Ближе к концу стадии блокирования разбавляют антитело до vGlut1 от одного до 2000 в блокирующем и проникающем буфере.

Обратите внимание, что это разведение может отличаться в зависимости от компании и партии используемого антитела. Инкубируйте срезы в растворе первичного антитела в течение ночи при четырех градусах Цельсия. Используйте встряхивающую платформу с энергичным движением.

Равномерное распределение первичных и вторичных антител важно для оптимального окрашивания. По нашему опыту, энергичное встряхивание обеспечивает наилучшее проникновение антител. После инкубации в первичном антителе промойте срезы трижды в PBS в течение 10 минут каждый раз, как и раньше.

Во время последней промывки разведите соответствующие вторичные антитела один к 500 в блокирующем буфере. Затем выдержите срезы в этом растворе в течение двух-трех часов при комнатной температуре. Убедитесь, что срезы защищены от света, так как вторичные антитела светочувствительны.

После мытья ломтиков, как и раньше, с помощью щетки осторожно снимите ломтики с 24-луночной пластины и равномерно разместите их на предварительно маркированных стеклянных предметных стеклах. Добавьте каплю монтажного средства поверх каждого ломтика. А затем, аккуратно положите поверх ломтиков стеклянную покровную крышку, стараясь не допустить образования пузырьков воздуха.

Защищайте от света и дайте предметным стеклам высохнуть в течение как минимум трех-четырех дней при комнатной температуре. Храните предметные стекла при температуре четыре градуса Цельсия в краткосрочной перспективе. Но для длительного хранения держите их при температуре минус 20 градусов по Цельсию.

Начните с использования 10-кратного или 20-кратного объектива для определения области гиппокампа, которую необходимо изобразить, в данном случае синапсов между пирамидальными нейронами CA1 и коллатеральными аксонами Шаффера. Перейдите на объектив для погружения в масло 40x или 63x и убедитесь, что анатомия среза не повреждена, определив непрерывные нейриты и организованную структуру. Используйте в качестве эталона нейронный маркер, например MAP2.

Отрегулируйте параметры для каждого канала для получения оптимального сигнала и контраста с разрешением 1,024 на 1,024 пикселя. Установите интенсивность каждого лазера, чтобы избежать насыщения каких-либо пикселей. Оцените глубину равномерного окрашивания, а затем настройте программное обеспечение на получение стеков изображений не менее восьми равноудаленных 250-нанометровых плоскостей.

Затем возьмите три смежные репрезентативные стопки изображений из одной и той же области интереса для каждого среза. Повторите сбор не менее чем в три среза на одно условие и от шести до восьми животных на группу обработки. Возбуждающие синапсы могут быть идентифицированы путем колокализации между vGlut1 и PSD95, на что указывают белые стрелки на изображении с большим увеличением.

Блокада передачи сигналов Wnt в гиппокампе взрослого человека путем индукции антагониста Wnt Dkk1 вызывает потерю возбуждающих синапсов, в частности, в радиатуме CA1. Процент возбуждающих синапсов между контрольной группой и мышами iDkk1 был количественно определен и оказался значительно ниже у трансгенных животных iDkk1. Тормозные синапсы могут быть идентифицированы по колокализации между vGat и гефирином.

Процент тормозных синапсов между контрольной группой и мышами iDkk1 был количественно определен, и существенной разницы не обнаружено. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что нужно быть как можно более осторожным с ломтиками. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как оценить синаптическую плотность в срезах мозга ex vivo.