На основе Фурье дифракции анализ Live Caenorhabditis elegans

Общая цель этого дифракционного анализа на основе Фурье состоит в том, чтобы охарактеризовать локомоцию C. elegans в режиме реального времени, когда вид свободно перемещается в трехмерном пространстве. Этот метод может ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии, описывая реакцию видов на различные плотности раствора или локомоторных мутантов. Этот метод служит исходной линией для фурье-анализа микроскопических веществ.

Его преимущество заключается в том, что каждый микроскопический вид будет иметь свой собственный уникальный спектр Фурье. Хотя этот метод может дать представление о передвижении C. elegans, он также может быть применен к другим микроорганизмам. Как правило, люди, не знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что найти нематоду в кювете под лазерным лучом может быть непросто.

Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы попытались узнать о поведении при плавании по сигналу временной дифракции, который сам по себе является шумным сигналом. Для начала закрепите гелий-неоновый лазер в левом заднем углу оптического верстака и подключите его к источнику питания. Поместите фильтр нейтральной плотности между лазером и местом расположения образца, чтобы лазерный луч проходил через фильтр, прежде чем достичь образца.

Используя два алюминиевых зеркала рулевого управления с передней поверхностью, соорудите перископ, закрепив первое зеркало после фильтра нейтральной плотности. Затем закрепите второе зеркало примерно в 10 сантиметрах ниже первого, чтобы дать место для направления лазерного луча. Вставьте кювету между зеркалами и совместите лазерный луч и кювету так, чтобы лазерный луч проходил вертикально через кювету.

Затем закрепите фотодиод прямо напротив второго зеркала так, чтобы его датчик был обращен к зеркалу. Затем поставьте на подставку кювету, наполненную водой. Отрегулируйте высоту подставки и углы зеркал один и два так, чтобы лазерный луч проходил через кювету и был направлен вблизи, а не прямо на фотодиод.

Используйте рычаг, чтобы подставка образовывала ровную поверхность для кюветы. Если подставка не выровнена, внесите соответствующие регулировки до полного уровня. Наконец, подключите фотодиод к цифровому осциллографу с помощью прилагаемого USB-кабеля и подключите его к компьютеру.

Загрузите программное обеспечение осциллографа и установите частоту дискретизации не менее восьми герц, чтобы в достаточной степени разрешить цикл выброса червя. Используйте тонкую плоскую платиновую проволоку, чтобы перенести четырех взрослых нематод в свежую чашку Петри, наполненную агаром NGM. Затем извлеките одноразовую пластиковую кювету из упаковки, стараясь касаться кюветы только ее ребристыми сторонами.

Затем используйте микропипетку для дозирования дистиллированной воды в кювету до тех пор, пока кювета не будет заполнена дистиллированной водой примерно на 80%. Поместите чашку Петри, содержащую C. elegans, под препарирующий эндоскоп. Затем с помощью платинового медиатора извлеките один зрелый C. elegans из чашки Петри и погрузите медиатор в кювету.

Перемещайте кирку по кругу, чтобы при необходимости выбить нематоду. Обращайтесь с нематодами осторожно и не трясите кювету. Встряхивание кюветы может привести к тому, что черви перестанут реагировать.

Чтобы предотвратить образование пузырьков в кювете, заполните кювету дистиллированной водой до тех пор, пока она слегка не сдвинется над верхней частью кюветы. Затем наполните колпачок водой и быстро наденьте колпачок на кювету. С помощью линзовой бумаги удалите все капли воды, которые могли пролиться на кювету.

Кроме того, используйте бумагу для линз, чтобы удалить мелкие оставшиеся капли. Включите гелиево-неоновый лазер и отрегулируйте настройку частоты так, чтобы он выдавал красный луч. Затем включите датчик.

Держите кювету за ее ребристые стороны и аккуратно наклоняйте ее до тех пор, пока нематода не окажется примерно в центре кюветы. Затем поместите кювету на подставку в оптической системе, центрируя червячка внутри лазерного луча, идущего от зеркала один к зеркалу два. Далее расположите фотодиод в дифракционной картине так, чтобы расположение фотодиода и центральный максимум дифракционной картины не совпадали.

Затем поверните фильтры нейтральной плотности так, чтобы на выходе фотодиода было заметное напряжение. Обязательно ограничьте свет с помощью фильтра нейтральной плотности, чтобы фотодиод не переполнялся насыщенностью. Плоская линия указывает на перенасыщение или недостаток интенсивности.

Как только движущаяся дифракционная картина станет видимой, соберите данные с помощью фотодиода, нажав кнопку «Пуск» в программном обеспечении, управляя осциллографом и наблюдая за движением червя. Продолжайте проводить измерения до тех пор, пока червяк не уйдет из лазерного луча и дифракционная картина не исчезнет. Если кювета поцарапана, утилизируйте ее вместе с червем и начните сначала.

Примерно через 20 секунд остановите процесс сбора данных, нажав кнопку «стоп» на программном обеспечении для осциллографа. Сохраняйте данные каждой пробной версии в виде значений, разделенных запятыми, или в текстовом формате. Соберите не менее 50 наборов данных для каждого фенотипа и используйте от 8 до 10 животных в каждом испытании.

Здесь показаны примеры смоделированного последовательного движения червяка и соответствующие дифракционные картины. Смоделированные дифракционные картины качественно напоминают экспериментальные картины и свидетельствуют об успешном моделировании нематоды. Кроме того, временная дифракционная сигнатура роликового и дикого типа c elegans может быть показана количественно.

Как видно на рисунке, каждая нематода бьется с разной скоростью и амплитудой. Усредненные цифровые преобразования Фурье позволяют идентифицировать нематоду по амплитуде их дифракционного частотного спектра. В спектре червей дикого типа преобладают более низкие частоты, чем в спектре движения ролика.

Вот пример w-колебания, которое можно представить как два противоположных движения моря. В отличие от этого, ролик в основном образует букву С одной стороны и выглядит следующим образом. При рассмотрении частот w-движение является более сложным, выявляя больше вторичных низких частот, чем c-движение.

После освоения один набор данных может быть собран примерно за две минуты, если техника выполнена правильно. Настройка оптики для ряда наборов данных занимает от 20 до 30 минут. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о бережном обращении с C. elegans, чтобы сохранить целостность их передвижения.

Следуя этой процедуре, мы можем применить другие методы, такие как реконструкция трактора и нелинейный анализ, чтобы узнать больше о движении C. elegans. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области нейробиологии к более глубокому изучению локомоторных мутантов у C. elegans. После просмотра этого видео у вас должно сложиться довольно хорошее понимание того, как генерировать дифракционные картины для живых нематод и как их анализировать.

Не забывайте, что работа с лазерами может быть чрезвычайно опасной, и во время выполнения процедуры следует принимать меры предосторожности, такие как не позволять лазерам перемещаться на уровне глаз.