В естественных условиях Смешанных изображений и анализ мыши лазерно индуцированным хориоидеи неоваскуляризация модели

Неоваскулярные процессы являются характерным признаком нескольких распространенных патологий глаза. Наиболее заметно экссудативная возрастная макулярная дегенерация или влажная ВМД при кратковременной, пролиферативной диабетической ретинопатии и ретинопатии недоношенных. В совокупности эти расстройства являются причиной большинства случаев юридической слепоты во всем мире и связаны с дополнительными глазными осложнениями, такими как кровоизлияние в стекловидное тело и неоваскулярная глаукома.

Однако, несмотря на их распространенность, терапевтические возможности при глазных неоваскулярных расстройствах ограничены. В настоящее время стандартом лечения неоваскуляризации, связанной с ВМД и пролиферативной диабетической ретинопатией, является интравитреальное введение гуманизированных антител, направленных против важнейшего медиатора ангиогенеза и неоваскуляризации, фактора роста эндотелия сосудов или VEGF. Однако, несмотря на эффективность в остановке прогрессирования заболевания и улучшении функционального зрения, интравитреальные инъекции являются дорогостоящими и далеко не лишены риска.

Осложнения могут включать инфекции, эндофтальмит, отслоение сетчатки и кровоизлияние в глаза. Таким образом, существует острая необходимость в разработке новых вариантов лечения, которые были бы эффективными, безопасными и менее дорогостоящими. Для продвижения разработки лекарств для лечения неоваскулярных заболеваний модели мелких животных имеют решающее значение.

Такие модели должны быть воспроизводимыми, иметь установленные и валидированные показания и конечные точки, а в идеале использовать клинически значимое референтное соединение в качестве положительного контроля. В этом протоколе мы представим модель хориоидальной неоваскуляризации мышей, или ХНВ, которая является одной из наиболее часто используемых моделей как для изучения патофизиологических механизмов, способствующих ХНВ, так и для разработки новых антинеоваскулярных агентов. В модели CNV мембрана Бруха разрывается с помощью аргонового лазера.

Тем самым инициируются неоваскулярные процессы, идущие из сосудистой оболочки глаза. Использование продольной визуализации in vivo с помощью спектральной оптической когерентной томографии, или сокращенно SD-ОКТ, и флуоресцеиновой ангиографии позволяет отслеживать пролиферацию и регрессию CNV. И, таким образом, оценить эффективность и сроки применения новых фармацевтических вмешательств.

Кроме того, последние достижения в области обработки изображений позволяют проводить автоматическую сегментацию для измерения толщины сетчатки, обеспечивая методологию, свободную от предвзятости исследователя для оценки наличия отека. В этой статье мы обсудим полезность нового программного обеспечения InVivoVue Diver от Leica Microsystems для автоматизированной сегментации слоев сетчатки в модели CNV мыши. Наконец, мы обсудим, как гистологический анализ целых креплений сетчатки может дополнить продольную визуализацию in vivo в этой модели.

Одна капля тропикамида наносится на каждый глаз для расширения зрачков. Затем животное аккуратно помещают в стадию выравнивания грызунов. Мышь регулируется таким образом, чтобы обнажить глаз, и фиксируется с помощью держателя для носа и куска лабораторного скотча, аккуратно помещенного на заднюю часть.

Далее капля смазки наносится на глаз для увлажнения, а излишки жидкости аккуратно удаляются с помощью тампонов из фильтровальной бумаги. Наконец, предметный столик выравнивается перед устройством ОКТ для базовой ОКТ-визуализации. Спектральная оптическая когерентная томография in vivo выполняется на исходном уровне, до применения лазера, чтобы убедиться в отсутствии каких-либо аномалий сетчатки.

Аккуратно извлеките мышь из держателя. Нанесите одну каплю геля Viscotears Gel на покровную пластинку, чтобы апримазать роговицу. Сориентируйте мышь так, чтобы диск зрительного нерва находился в центре, и сфокусируйте лазерный луч на пигментном эпителии сетчатки.

Сделайте три лазерных укола, избегая кровеносных сосудов сетчатки в положении 4, 8 и 12 часов вокруг зрительного нерва. Осмотрите твердость глаза после всех лазерных снимков на предмет отсутствия кровоизлияния в сетчатку. Как и раньше, выровняйте мышь в держателе и проведите флуоресцеиновую ангиографию и ОКТ-томографию для подтверждения повреждения мембраны Бруха.

При флуоресцентной ангиографии в первую очередь фокусируется на участках лазерного ожога с использованием инфракрасного режима отражения, который позволяет визуализировать участки, на которые вводился лазер. Осторожно введите 0,1 миллилитра 5% флуоресцеина натриевой соли примерно на 20 граммов массы тела мыши, не меняя положения глаз мыши. Начните делать снимки флуоресцентной ангиографии на уровне сосудистой оболочки и на уровне сетчатки, примерно каждые 30 секунд.

Выровняйте глаз для ОКТ-визуализации, как и раньше, и начните визуализацию. Усреднение сигнала SD-ОКТ помогает лучше визуализировать детальную морфологию сетчатки, как показано в этой последовательности. После выполнения SD-ОКТ-визуализации осторожно извлеките мышь из держателя.

Нанесите лубрикант для обоих глаз. На этом этапе вы можете выбрать обратную анестезию путем подкожной инъекции альфа-2 антагониста медетомидина, атипамезола или дождаться восстановления животного после анестезии. Повторите визуализацию in vivo SD-ОКТ и ФА у животных, находящихся под наркозом, на 5, 10 и 14 день наблюдения.

Используйте функцию автоматической сегментации в программном обеспечении InVivoVue Diver для измерения толщины сетчатки. Для здоровой сетчатки общая толщина сетчатки рассматривается как толщина всех слоев, от слоя нервных волокон до СИЗД. В здоровой сетчатке автоматическая сегментация может точно обнаруживать отдельные слои сетчатки, как видно на этом примере.

Стоит отметить, что в местах присутствия ХНВ ручное измерение толщины сетчатки следует проводить для каждого участка поражения ХНВ отдельно. От слоя нервных волокон к воображаемой линии, проходящей через слой РПЭ. В этой последовательности показан рабочий процесс ручного измерения толщины в местах, где присутствуют поражения CNV.

Слой нервных волокон расположен в верхней части, сосудистая оболочка – в нижней части изображения. С помощью мыши или тачпада границы слоя нервных волокон и сосудистой оболочки определяются вручную, и программное обеспечение автоматически рассчитывает общую толщину сетчатки на основе этих координат. На этом рисунке показаны серийные изображения, сделанные каждые 20 секунд на уровне хориоидеи.

Изображение 1 было получено в режиме инфракрасного отражения. Тогда как остальные, после внутрибрюшинного флуоресцеинового введения. Белые стрелки на одном изображении указывают на участки, подвергнутые лазерному воздействию, которые показывают утечку флуоресцеина в более поздние моменты времени, выделенные белыми стрелками на изображении 18.

На этом изображении показана серийная визуализация ФА, полученная на уровне сетчатки. Белая стрелка на изображении 18 указывает на участок, обработанный лазером, который показывает, что утечка флуоресцеина проявляется быстрее, чем два других, обведенных кругами на изображении 18. На этом сводном рисунке показан временной ход SD-OCT-изображений.

На исходном уровне, сразу после лазерной обработки, и время наблюдения указывает на пятый, 10-й и 14-й дни. Таким образом, протокол продольной визуализации поражений ХНВ in vivo с использованием SD-ОКТ и ФАК позволяет быстро, мультимодально и надежно классифицировать патологию ХНВ и наличие отека сетчатки. Спасибо за проявленный интерес.