Рассечение и Immunofluorescent окрашивание гриб тело и фоторецепторных нейронов в мозге взрослого Drosophila melanogaster

Общая цель этого протокола вскрытия мозга дрозофилы состоит в том, чтобы получить интактный мозг взрослых мух, который может быть использован в широком спектре приложений, таких как иммунофлуоресценция, локализация белка с меткой GFP и эксперименты по культивированию ex-vivo. Этот метод может помочь нам ответить на ключевые вопросы в области биологии развития и нейробиологии, такие как роль конкретных белков и сигнальных путей, а также установление паттернов нейронных связей во время развития мозга. Основное преимущество этой методики заключается в том, что после освоения она обеспечивает быстрый и эффективный метод иммунологической идентификации морфологических дефектов в конкретных областях мозга взрослого человека.

Этой процедуре может быть трудно научиться, потому что удаление экзоскелета из головы мухи может потребовать большой осторожности и практики. Ваши движения должны быть медленными и обдуманными, а руки диссектора должны хорошо поддерживаться, чтобы оставаться устойчивыми. Хорошей идеей будет попрактиковаться на красноглазых мухах, а затем на белоглазых мухах, прежде чем приступать к анализу генотипов, представляющих интерес для реальных экспериментов.

Чтобы подготовиться к вскрытию, поместите находящихся под наркозом мух на холодную металлическую подушку или в чашку Петри, сидящую на льду. В качестве альтернативы можно использовать накладку на муху, которая выделяет углекислый газ. Затем поместите небольшое количество PTN в центр чашки для препарирования, чтобы создать пузырь PTN.

Затем под стереомикроскопом заполните поле зрения пузырьком PTN при равномерном освещении. Теперь манипулируйте мухами так, чтобы они располагались брюхом вверх, и перенесите одну из них за брюшко в PTN. Полностью погрузите животное в ПТН, а затем выполните полное вскрытие в ПТН.

С помощью второй пары щипцов возьмитесь за хоботок и оторвите головку от тела. Время от времени хоботок удаляется, но голова остается прикрепленной к телу. В этом случае возьмитесь за медиальный край одной сетчатки и приложите боковую силу, чтобы удалить голову.

Отбросьте брюшную полость и грудную клетку. Очень важно держать голову в ПТН во время этого этапа. Связи между центральным мозгом и VNC явно не могут быть проанализированы с помощью этого метода.

Затем возьмитесь за медиальный край левой сетчатки по краю центрального отверстия в кутикуле и медленно оттяните щипцы непосредственно друг от друга, чтобы предотвратить разрыв зрительной доли, которая представляет собой непрозрачную структуру, покрытую белой волокнистой трахеей. По мере диссоциации сетчатки происходит небольшое снижение напряжения. Чтобы предотвратить разрыв мозга, критически важно захватить медиальный край каждого глаза и очень медленно раздвинуть щипцы.

Слишком быстрое движение может привести к изменению морфологии мозга или повреждению мозговой ткани. Как показано здесь, захватите кутикулу каждой парой щипцов и очень медленно потяните их в противоположных направлениях. Если все сделано правильно, кутикула должна отделиться от мозговой ткани, оставив мозг нетронутым.

Для этого шага нужны очень острые щипцы. Далее аккуратно удаляйте окружающую кутикулу по частям. Удаляя упрямо прикрепленную кутикулу, он может помочь обезопасить мозг, захватывая оставшийся VNC, чтобы избежать раздавливания мозга.

Наконец, с помощью пипетки P200 перенесите препарированный мозг в лунку планшета, заполненную PTN для фиксации и иммуноокрашивания. Под микроскопом с помощью пипетки P200 перенесите от 10 до 15 рассеченных мозгов одного и того же генотипа в микроцентрифужную пробирку объемом 0,5 миллилитра, заполненную 4% параформальдегида, разведенным в ПТН. Затем инкубируйте мозги в течение 20 минут с медленным покачиванием при комнатной температуре.

После фиксации дайте мозгу осесть на дно трубки, затем снимите фиксатор. Далее выполните две быстрые промывки с 500 микролитрами PTN на одну стирку. Обменивайте ПТН, как только мозги осядут в трубе.

Далее выполните три длительные промывки PTN с помощью бережного перемешивания при комнатной температуре. После этих промываний мозг может храниться в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия в PTN. После снятия последней промывки ПТН инкубируйте мозги в 0,5 миллилитрах блокирующего раствора не менее 30 минут при комнатной температуре, причем при слабом перемешивании.

После удаления блокирующего раствора добавьте первичные антитела, разведенные в блокирующем растворе, и инкубируйте мозг при четырех градусах Цельсия в течение двух дней с легким перемешиванием. Удалите первичное антитело с помощью пяти полос промывки ПТН. А затем примените вторичные антитела.

Дайте этим антителам инкубироваться с тканями в течение трех часов при комнатной температуре, будучи защищенными от света с помощью качания. После инкубации мозгов в растворе вторичных антител примените полку промывки ПТН. Накрывайте образцы фольгой после каждой стирки и в завершение удаляйте как можно больше буфера.

Затем добавьте 75 микролитров флуоресцентной монтажной среды, препятствующей выцветанию, и проведите мозг и среду внутрь и наружу наконечника пипетки всего один раз. Затем трубку можно завернуть в фольгу и хранить при температуре четыре градуса Цельсия в течение нескольких дней, но в идеале приступать непосредственно к монтажу. Чтобы смонтировать мозги, соорудите горку-мост.

Расположите две нижние крышки на расстоянии примерно 1 сантиметра друг от друга на положительно заряженном затворе. Убедитесь, что положительно заряженная сторона лежит лицевой стороной вверх. Затем приклейте покровные листы к предметному стеклу лаком для ногтей и дайте лаку полностью высохнуть, прежде чем продолжить.

Далее поместите предметное стекло под стереомикроскоп, а пипеткой наведите мозги и носитель в пространство между защитными стеклами. Обязательно отрегулируйте освещение для улучшения визуализации мозга. Затем откачайте дополнительную монтажную среду от предметного стекла, стараясь не задеть мозги.

Затем отвлеките остатки излишков монтажного материала. Это позволит более точно расположить мозги. Теперь, используя щипцы, сориентируйте мозг в виде сетки, так, чтобы их доли усиков были обращены вверх.

Затем наденьте защитный лист на мозги и с помощью лака для ногтей запечатайте края верхнего покровного листка, которые прикреплены к базовым покровным листам. Теперь нагрузите центральную полость свежим монтажным материалом по каплям, позволяя фильтрующему материалу втягиваться под защитное стекло капиллярным действием. Когда полость будет заполнена, полностью запечатайте ее прозрачным лаком для ногтей.

Описанный метод может быть использован для визуализации практически любой структуры мозга взрослого человека, в том числе и тел грибов. Эта область мозга необходима для обучения и памяти. Тела грибов можно легко визуализировать с помощью антител, которые распознают белок фасцикулин 2.

Этот белок высоко экспрессируется в альфа- и бета-долях, а также в центрально расположенном эллипсоидном теле. Этот метод позволил идентифицировать множество клеточных процессов, необходимых для правильного аксонного направления нейронов грибовидных тел. Нарушение этих процессов вызывает широкий спектр мутантных фенотипов, таких как неправильная проекция аксонов через среднюю область мозга и отсутствие альфа-долей.

Эти мутантные фенотипы часто не являются полностью пенетрантными, и поэтому требуют исследования множественного мозга. Для изучения автономной роли белка в поиске путей аксонов, метод Маркхэма также может быть использован для визуализации решений по наведению аксонов отдельных GFP-положительных мутантных нейронов или нейронов дикого типа на фоне нефлуоресцентного дикого типа. Описанный здесь метод позволяет обеспечить надежную и воспроизводимую визуализацию практически всей области мозга взрослой дрозофилы.

Здесь мы сосредоточились на нейронах грибовидного тела. В текстовой версии этого протокола мы также продемонстрировали визуализацию лепестков зрительного нерва. В других исследованиях использовались аналогичные методы для визуализации pars intercerebralis, часовых нейронов и нейронов проекции антенных долей, среди многих других.

После освоения каждый мозг может быть препарирован за 3-5 минут, если это сделано правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о стабилизации рук рядом с микроскопом. Также важно двигаться медленно и удалять небольшие кусочки кутикулы по одному.

Слишком быстрое движение может привести к нежелательному повреждению подлежащей ткани мозга. В дополнение к использованию вскрытого мозга для экспериментов на основе иммунофлуоресцентной микроскопии, ткань мозга также может быть использована для дополнительных экспериментов.