Потока на основе цитометрии наркотиков скрининг системы для идентификации малых молекул, которые способствуют клеточной дифференцировки стволовых клеток глиобластомы

Общая цель данной процедуры заключается в скрининге библиотек малых молекул для поиска агентов, стимулирующих астроглиальную дифференцировку стволовых клеток глиобластомы. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области исследования стволовых клеток рака, например, какие сигнальные пути необходимы для поддержания стволовых клеток глиобластомы в недифференцированном состоянии. Правильное выполнение данной методики позволяет осуществлять прямое выявление малых молекул, способствующих дифференцировке стволовых клеток глиобластомы.

Значимость данной методики распространяется на терапию глиобластомы при синдроме Элерса-Данлоса, поскольку снижение процента стволовых клеток глиобластомы может уменьшить вероятность рецидива. Этот метод также может быть применен для настройки дифференцировки в другие клеточные линии с использованием других репортерных конструкций. Наш отчет является первым, в котором представлен высокопроизводительный подход к скринингу агентов, которые заставляют стволовые клетки глиомы дифференцироваться.

Работа с частицами лентивируса в раковых клетках, полученных от пациентов, может быть крайне опасной. Поэтому следует всегда соблюдать стандартные процедуры работы с гемоконтактными патогенами. Для начала высейте один миллион стволовых клеток глиобластомы или GSCs в два миллилитра полной среды для роста нейральных стволовых клеток в шестилуночный планшет.

Затем проведите трансдукцию клеток лентивирусным репортером с множественностью заражения (MOI), равной 5. К смеси клеток и вируса добавьте 2 µL полибренa так, чтобы конечная концентрация составила 8 µg/mL, и инкубируйте клетки при 37 °C и 5% CO2 в течение ночи. После инкубации замените ростовую среду, чтобы удалить несвязавшийся вирус.

Центрифугируйте клетки при 360 ×g в течение пяти минут. Затем осторожно аспирируйте среду и перенесите клетки обратно в шестилуночный планшет. Продолжайте инкубацию клеток в течение 24 часов.

Отберите 0,5 мл общего объема культуры. Осадите клетки путем центрифугирования при 360 ×g в течение пяти минут при комнатной температуре. Ресуспендируйте клетки в 0,5 мл свежей среды для роста нейральных стволовых клеток.

Поместите планшет обратно в инкубатор минимум на 72 часа для экспансии клеток. Добавьте 200 µL реагента для диссоциации и инкубируйте в течение пяти минут на водяной бане при температуре 37 °C. Проведите диссоциацию клеток путем осторожного пипетирования вверх-вниз.

К диссоциированным клеткам добавьте 800 µL HBSS, чтобы минимизировать прикрепление или агрегацию клеток. Затем перенесите по 200 µL каждой клеточной суспензии в лунки 96-луночного планшета. Определите процент клеток, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок, с помощью проточной цитометрии.

Регистрируйте не менее 10 000 жизнеспособных клеток при каждом сборе данных. Для всех анализов методом проточной цитометрии используйте родительские нетрансдуцированные клетки или нетрансдуцированные флуоресцентным белком клетки, трансдуцированные вектором, для установления базового уровня флуоресценции. Для селекции и экспансии отдельных субклонов высевайте клетки с плотностью 0,7 клетки на лунку в 100 µL среды для нейральных стволовых клеток в 96-луночный планшет.

Культивируйте эти клоны в течение 11 дней. Отбирайте нейросферы с диаметром более 100 микрон. Ранее мы установили этот пороговый размер для ретроспективного определения того, была ли нейросфера образована самообновляющейся стволовой клеткой глиобластомы.

Этот пороговый размер может потребовать оптимизации при работе с различными моделями клеток глиобластомы. Осмотрите клетки под флуоресцентным микроскопом, оснащенным FITC-фильтром, и отметьте лунки, содержащие одну нейросферу, в которой примерно от 1% до 5% клеток являются GFP-положительными. После маркировки выращивайте отдельные клоны до тех пор, пока не будет получено достаточное количество клеток для проведения анализа методом проточной цитометрии.

При условии, что клоны репортеров содержат от 1% до 5% GFP-положительных клеток, соберите по 0,5 мл из каждого клона вместе с равным количеством нетрансдуцированных контрольных клеток для определения точного процента GFP-положительных клеток. После осаждения клеток при 360 ×g в течение пяти минут при комнатной температуре аспирируйте супернатант. Добавьте 200 мкл реагента для диссоциации к каждому осадку и инкубируйте пробирки на водяной бане при 37 °C.

После инкубации тритурируйте клетки примерно 20–30 раз до получения суспензии из отдельных клеток. Затем добавьте 800 µL HBSS, чтобы минимизировать прикрепление или агрегацию клеток. Теперь перенесите по 200 µL каждой клеточной суспензии в лунки 96-луночного планшета.

Наконец, проведите проточную цитометрию, зарегистрировав не менее 10 000 жизнеспособных клеток при каждом цикле сбора данных. Для оценки клоногенной способности подготовьте суспензии единичных клеток субклонов с репортером дифференцировки путем тритурации клеток примерно 20–30 раз. Затем высейте эти клетки в 100 µL полной среды для роста нейральных стволовых клеток с плотностью примерно от 5 до 500 клеток на лунку в 96-луночные планшеты.

Культивируйте эти клетки в течение девяти-11 дней. Обнаружите нейросферы с помощью светового микроскопа. Лунка, содержащая как минимум одну крупную одиночную нейросферу, считается положительной.

Используя в качестве контролей родительские нетрансдуцированные клетки и GFP-положительные клетки, трансдуцированные лентивирусом, введите в онлайн-интерфейс ELDA общее количество проанализированных лунок и число положительных клеток. Чтобы начать скрининг, посейте 5000 клеток в 99 µL полной среды для роста нейральных стволовых клеток в 96-луночный планшет. Затем с помощью 12-канального дозатора обработайте клетки разведенными соединениями из библиотеки до конечной концентрации 2 µM или контролем DMSO.

Инкубируйте клетки в течение 72 часов. Затем добавьте в каждую лунку по 150 µL реагента для диссоциации клеток с помощью 12-канального дозатора и инкубируйте при 37 °C в течение 20 минут. После этого аккуратно тритурируйте клетки в каждой лунке примерно 20–30 раз с помощью 12-канального дозатора до получения суспензии одиночных клеток.

Теперь проведите проточную цитометрию и определите процент клеток, экспрессирующих репортер GFAP:GFP. Сначала определите размер и жизнеспособность клеток по прямому и боковому светорассеянию и выделите популяцию жизнеспособных клеток. Затем определите количество GFP-положительных клеток в данной популяции жизнеспособных клеток.

Увеличение процента GFP-положительных клеток на три стандартных отклонения по сравнению с контролем считается положительным результатом; этот порог может быть скорректирован в зависимости от предпочтений пользователя относительно строгости отбора. Представлены репрезентативные изображения субклонов GSC HSR-GBM1 с низким и высоким уровнями экспрессии GFAP:GFP. Субклоны с положительной экспрессией GFAP:GFP для линии нейросфер, полученной от пациента, были отобраны с помощью проточной цитометрии.

Здесь низкий уровень GFAP:GFP означает, что менее 5% клеток в клоне являются GFP-положительными, в то время как высокий уровень GFAP:GFP означает, что более 75% клеток в клоне являются GFP-положительными. Эти результаты показывают, что способность к самообновлению in vitro у субклонов с низким уровнем GFAP выше, чем у их аналогов с высоким уровнем GFAP, что было определено с помощью ELDA. Следовательно, субклоны GH более дифференцированы, чем субклоны GL.

Наконец, был проведен скрининг библиотек лекарственных препаратов для поиска агентов, способных индуцировать астроглиальную дифференцировку в GSCs. Было обнаружено 12 препаратов, которые значительно увеличивают процент клеток, экспрессирующих репортер GFAP:GFP. После освоения эта методика может быть выполнена за несколько недель при условии ее правильного проведения.

После выполнения данной процедуры можно провести другие методы, такие как анализ alamarBlue, клоногенный анализ в полутвердых средах, подкожное или внутричерепное введение ксенографтов, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, о влиянии селективных препаратов на пролиферацию и клоногенность клеток in vitro и на туморогенность in vivo. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как идентифицировать соединения, способные индуцировать астроглиальную дифференцировку стволовых клеток глиобластомы.