Потока на основе цитометрии наркотиков скрининг системы для идентификации малых молекул, которые способствуют клеточной дифференцировки стволовых клеток глиобластомы

Общая цель этой процедуры заключается в скрининге малых молекулярных библиотек на наличие агентов, способствующих астроглиальной дифференцировке в стволовых клетках глиобластомы. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области раковых стволовых клеток, например, какие сигнальные пути необходимы для поддержания стволовых клеток глиобластомы в недифференцированном состоянии. Правильное выполнение этого метода позволяет напрямую идентифицировать малые молекулы, которые способствуют дифференцировке стволовых клеток глиобластомы.

Применение этого метода распространяется на терапию глиобластомы Элерса-Данлоса, поскольку снижение процента стволовых клеток глиобластомы может снизить вероятность рецидива. Этот метод также может быть применен для установки дифференцировки в другие клеточные линии с использованием других репортерных конструкций. Наш отчет является первым, в котором разработан высокопроизводительный подход к скринингу агентов, которые заставляют стволовые клетки глиомы дифференцироваться.

Работа с частицами лентивируса в раковых клетках, полученных от пациентов, может быть чрезвычайно опасной. Поэтому всегда следует придерживаться стандартного порядка работы с возбудителями, передающимися через кровь. Для начала посейте один миллион стволовых клеток глиобластомы или ГСК в два миллилитра полной среды для роста нервных стволовых клеток в шестилуночной тарелке.

Далее проводят трансдукцию клеток с лентивирусным репортером при кратности инфекции, равной пяти. В смесь клеток и вирусов добавьте два микролитра полибрена так, чтобы конечная концентрация составила восемь микрограммов на миллилитр, и инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2 в течение ночи. После инкубации замените питательную среду для удаления несвязанного вируса.

И центрифугируйте ячейки при 360-кратной G в течение пяти минут. Затем осторожно отсадите средние и пластинчатые клетки обратно в шестилуночный планшет. И продолжают инкубировать клетки в течение 24 часов.

Собирают урожай 0,5 миллилитра от общего объема культуры. Пеллетные ячейки методом центрифугирования при 360-кратном перегрузке в течение пяти минут при комнатной температуре. Ресуспендируйте клетки в 0,5 миллилитрах свежей среды для роста нейральных стволовых клеток.

Поместите пластину обратно в инкубатор, чтобы она могла расшириться не менее чем на 72 часа. Добавьте 200 микролитров диссоциационного реагента и выдерживайте в течение пяти минут на водяной бане, установленной до 37 градусов Цельсия. Диссоциируйте клетки путем мягкого пипетирования вверх и вниз.

К диссоциированным клеткам добавьте 800 микролитров HBSS, чтобы обеспечить минимальное прикрепление или агрегацию клеток. Далее перелейте по 200 микролитров суспензии каждой клетки в лунки 96-луночного планшета. Определить процент клеток, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок, методом проточной цитометрии.

Регистрируйте не менее 10 000 жизнеспособных клеток при каждом приобретении. Во всех проточных цитометрических анализах используют родительские нетрансдуцированные клетки или векторно-трансдуцированные нефлуоресцентные клетки для установления исходной флуоресценции. Отбирать и расширять отдельные субклоны затравочных клеток с плотностью 0,7 клеток на лунку в 100 мкл среды нейральных стволовых клеток в 96-луночном планшете.

Выдерживайте эти клоны в культуре в течение 11 дней. Обратите внимание на нейросферы диаметром более 100 микрон. Ранее мы установили этот предельный размер, чтобы ретроспективно определить, была ли нейросфера создана самообновляющейся стволовой клеткой глиобластомы.

Этот размер порога может потребовать оптимизации при работе с различными моделями клеток глиобластомы. Наблюдайте за клетками под флуоресцентным микроскопом, оснащенным фильтром FITC, и отметьте лунки, содержащие одну нейросферу, в которой примерно от 1% до 5% клеток являются GFP-положительными. После маркировки расширяйте отдельные клоны до тех пор, пока не будет доступно достаточное количество клеток для анализа проточной цитометрии.

Предполагая, что репортерные клоны содержат от 1% до 5% GFP-положительных клеток, соберите 0,5 миллилитра от каждого клона вместе с таким же количеством нетрансдуцированных контрольных клеток, чтобы определить точный процент GFP-положительных клеток. После гранулирования клеток при 360-кратном G в течение пяти минут при комнатной температуре отсасывайте надосадочную жидкость. Добавьте в каждую гранулу по 200 микролитров диссоциационного реагента и инкубируйте пробирки на водяной бане, установленной до 37 градусов Цельсия.

После инкубации растирайте клетки примерно от 20 до 30 раз, чтобы получить суспензию одной клетки. Затем добавьте 800 микролитров HBSS, чтобы обеспечить минимальное прикрепление или агрегацию клеток. Теперь перелейте по 200 микролитров суспензии каждой клетки в лунки 96-луночного планшета.

Наконец, проведите проточную цитометрию, регистрируя не менее 10 000 жизнеспособных клеток при каждом приобретении. Для оценки клоногенной способности готовят одиночные клеточные суспензии дифференцировочных репортерных субклонов путем растирания клеток около 20-30 раз. Затем поместите эти клетки в 100 микролитров полной среды для выращивания нейральных стволовых клеток с плотностью от 5 до 500 клеток на лунку в 96-многолуночных планшетах.

Сохраняйте эти клетки в культуре от девяти до 11 дней. Ищите нейросферы под световым микроскопом. Лунка, содержащая по крайней мере одну крупную нейросферу, считается положительной.

Рассматривая родительские нетрансдуцированные клетки и GFP-положительные лентивирус-трансдуцированные клетки в качестве контроля, общий объем анализируемых лунок и количество положительных клеток в онлайн-интерфейсе ELDA. Чтобы начать скрининг, поместите 5000 клеток в 99 микролитров полной среды для выращивания нейральных стволовых клеток в 96-луночный планшет. Затем с помощью 12-канальной пипетки обрабатывают клетки двухмикромолярной конечной концентрацией разбавленных библиотечных соединений или контролем ДМСО.

Инкубируйте клетки в течение 72 часов. Теперь добавьте в каждую лунку по 150 микролитров реагента для диссоциации клеток с помощью 12-канальной пипетки и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 20 минут. Затем осторожно растирайте клетки в каждой лунке от 20 до 30 раз с помощью 12-канальной пипетки до получения суспензии для одной клетки.

Теперь проведите проточную цитометрию и определите процент клеток, экспрессирующих репортер GFAP:GFP. Сначала определите размер и жизнеспособность клеток по прямому и боковому рассеивателям и определите жизнеспособную популяцию клеток. Затем определите GFP-положительные клетки в жизнеспособной клеточной популяции.

Увеличение процента GFP-положительных клеток на три стандартных отклонения по сравнению с контрольными элементами считается положительным попаданием, которое может быть скорректировано в соответствии с предпочтениями пользователя в отношении строгости. Показаны репрезентативные изображения субклонов HSR-GBM1 GSC, экспрессирующих низкие и высокие уровни GFAP:GFP. Субклоны, положительные на экспрессию GFAP:GFP, были отобраны с помощью проточной цитометрии для нейросферной линии, полученной от пациента.

Здесь низкий показатель GFAP:GFP указывает на то, что менее 5% клеток в клоне являются GFP-положительными, в то время как высокий уровень GFAP:GFP указывает на то, что более 75% клеток в клоне являются GFP-положительными. Эти результаты показывают, что способность к самообновлению in vitro субклонов с низким уровнем GFAP выше, чем у их аналогов с высоким уровнем GFAP, как определено по ELDA. Таким образом, субклоны GH более дифференцированы, чем субклоны GL.

Наконец, был проведен скрининг библиотек лекарств для выявления агентов, способных индуцировать астроглиальную дифференцировку в GSC. Было обнаружено, что 12 препаратов значительно увеличивают процент клеток, экспрессирующих репортера GFAP:GFP. После освоения этой техники ее можно сделать за несколько недель, если ее правильно выполнить.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как анализ alamarBlue, клоногенный анализ в полутвердых средах, фланговая или внутричерепная ксенографическая инъекция, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как влияние селективных препаратов на клеточную пролиферацию и клоногенность in vitro и онкогенность in vivo. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как идентифицировать соединения, способные индуцировать астроглиальную дифференцировку в стволовых клетках глиобластомы.