Индукция паралич и зрительной системы травмы в мышей, специфические клетки T нейромиелит Optica Аквапорин аутоантиген-4

Общие цели этого протокола заключаются в том, чтобы индуцировать аутоиммунное заболевание центральной нервной системы или ЦНС путем адоптивного переноса аквапорина 4-специфичных Т-клеток, а также контролировать результирующее воздействие на ЦНС и динамическую зрительную систему. Этот метод поможет ответить на ключевые вопросы, касающиеся роли аквапорина 4, широко известного как AQP4, специфических Т-клеток при оптическом нейромиелите, а также других воспалительных расстройствах зрения. Основным преимуществом оптической когерентной томографии является возможность проведения продольного мониторинга повреждения сетчатки неинвазивным способом.

Демонстрировать процедуру будут Шэрон Саган, научный сотрудник моей лаборатории, а также Андреас Круз Харанс, научный сотрудник лаборатории RE Greens. Начните с прикрепления трехстороннего нейлонового запорного крана с двумя наружными соединениями замка Люэра к стеклянному шприцу с замком Люэра без поршня. Поверните рычаг запорного крана в сторону шприца, чтобы закрыть запорный кран, и расположите шприц открытым концом вверх.

После вортекса добавьте в шприц объем пептида один к одному, раствор Complete Freund's Adjuvant и снова вставьте стеклянный поршень в шприц. Удерживая поршень на месте, переверните шприц так, чтобы запорный кран был обращен вверх, и переключите рычаг на неиспользуемое гнездовое соединение. Осторожно нажмите на поршень, чтобы удалить лишний воздух из шприца.

Раствор заполнит вторую наружную резьбу замка Люэра запорного крана. Затем прикрепите второй стеклянный шприц с полностью вставленным поршенем во второе соединение замка Люэра с наружной резьбой. Чтобы создать эмульсию, поочередно нажимайте на поршни, чтобы раствор прошел между двумя шприцами в течение примерно двух минут, и охлаждайте раствор в течение примерно 10 минут до тех пор, пока не произойдет видимое изменение вязкости раствора.

Когда образуется очень жесткая белая эмульсия, перелейте весь раствор в один из шприцев и замените пустой шприц новым шприцем с замком Люэра диаметром в один миллиметр. Наполните новый шприц эмульсией. Извлеките шприц из запорного крана и прикрепите иглу 25 калибра.

Чтобы проверить эмульсию водой на консистенцию, выдавите каплю эмульсии в небольшую емкость с водой. Если эмульсия не рассеивается, она пригодна для инъекций. Затем введите каждую донорскую мышь с нокаутом AQP4 подкожно по одному разу в каждую сторону нижней части живота и в каждую сторону грудной стенки медиально к подмышечной впадине.

Через 10-12 дней после иммунизации сделайте разрез по средней линии кожи от паха до шеи и вниз по каждой ноге первой мыши. Оттяните кожу от брюшины, и плотно закрепите ее на доске. Затем соберите паховые и подмышечные лимфатические узлы и поместите ткани в клеточный фильтр в чашке Петри, содержащей полную среду.

Когда все лимфатические узлы будут собраны, поместите клеточный фильтр на 50-миллилитровую коническую трубку, содержащую свежую полную среду со льдом, и используйте плоский конец стерильного пятимиллилитрового поршня шприца, чтобы продавить клетки лимфатических узлов через фильтрующую сетку. Промойте сетку 20-30 миллилитрами готовой среды, чтобы облегчить восстановление клеток, после чего последует два центрифугирования. После второго центрифугирования гранулу повторно суспендируют в среде Т-клеток для подсчета.

Добавьте к клеткам соответствующие концентрации антигена, рекомбинантного мышиного интерлейкина мыши 23 и рекомбинантного мышиного IL-6 и добавьте по два миллилитра клеток на лунку этой поляризационной смеси Th17 в каждую лунку 12-луночного планшета. Затем поместите тарелку во увлажненный инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия и 5% CO2 на 72 часа. На третий день поляризации несколько раз разотрите культуры в каждой лунке, чтобы вытеснить поляризованные клетки, и объедините их в 50-миллилитровую коническую пробирку на льду для подсчета.

После двух промывок в PBS разбавьте клетки до концентрации от 10 до 10 до восьми клеток на миллилитр в PBS и аккуратно перемешайте клеточную суспензию путем закручивания. В течение одного часа после их сбора переложите клетки в одномиллилитровый шприц и введите 200 микролитров клеток каждому животному-реципиенту внутривенно через хвостовую вену. Затем немедленно введите каждой мыши внутрибрюшинно и через два дня 200 нанограммов коклюшного токсина, разведенного в 200 микролитрах PBS.

Для визуализации сетчатки глаза животных-реципиентов in vivo с помощью оптической когерентной томографии, за пять минут до визуализации, расширьте зрачки одной каплей 1% тропикамида на каждый глаз и включите нагревательный коврик. Поместите мышь на цилиндр визуализации и перенаправьте поток анестезии соответствующим образом. Защитите глаза 0,3% гидроксипропилметилцеллюлозой, чтобы сохранить их влажными и обеспечить непрерывность рефракции, и наденьте на исследуемый глаз индивидуальные контактные линзы.

Руководствуясь инфракрасным изображением глазного дна, направьте лазер на глаз, покрытый хрусталиком, следя за тем, чтобы луч был центрирован на диске зрительного нерва. Выполните 25 B-сканов в режиме высокого разрешения и растрируйте изображения из 30 усредненных A-сканов. После визуализации обоих глаз замените контактную линзу офтальмологическим гелем и поместите мышь в теплую клетку для восстановления.

Чтобы проанализировать полученные изображения с помощью модульного программного обеспечения для визуализации для автоматической сегментации, сначала вручную скорректировайте сегменты, соответствующие внутренней пограничной мембране и внутреннему плексиформному слою, чтобы они представляли границы внутренних слоев сетчатки. Затем убедитесь, что нервные волокна сетчатки и слои ганглиозных клеток находятся в пределах внутреннего слоя сетчатки и что они не перекрываются. Подкожная иммунизация пептидами AQP4, содержащими патогенные эпитопы Т-клеток, вызывает сильные пролиферативные Т-клеточные ответы в дренирующих лимфатических узлах мышей с нокаутом AQP4 по сравнению с реакциями диких Т-клеток типа.

Проточный цитометрический анализ индивидуальной экспрессии V-бета показывает, что Т-клетки, специфичные к пептидам AQP4, которые содержат патогенные эпитопы Т-клеток, используют уникальные репертуары TCR, и демонстрируют селективную гиперпролиферацию, указывающую на то, что патогенные ответы Т-клеток на эти детерминанты обычно регулируются отрицательным отбором тимуса. Примерно через шесть-девять дней после инъекции поляризованных Т-клеток почти у всех мышей-реципиентов развились клинические признаки аутоиммунного заболевания ЦНС, включая хромой хвост и паралич задних конечностей. При этом Th17-поляризованные AQP4-специфичные Т-клетки вызывают более тяжелое клиническое заболевание, чем Th1-поляризованные AQP4-специфичные Т-клетки.

Например, у этой мыши развился полный паралич задних конечностей после введения Th17-поляризованных пептид-специфичных Т-клеток AQP4. Клиническое заболевание, вызванное пептид-специфичными клетками Th17 AQP4, также связано с инфильтрацией мононуклеарных клеток в паренхиму и мозговые оболочки ЦНС, а также с воспалением зрительного нерва, о чем дополнительно свидетельствует отек и увеличение толщины внутреннего слоя сетчатки, который возвращается к исходному уровню по мере выздоровления мышей от болезни. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как индуцировать и контролировать аутоиммунитет, нацеленный на AQP4, что позволит провести дальнейшие исследования для понимания того, как Т-клетки участвуют в оптическом нейромиелите.