Индукция паралич и зрительной системы травмы в мышей, специфические клетки T нейромиелит Optica Аквапорин аутоантиген-4

Общие цели данного протокола заключаются в индуцировании аутоиммунного заболевания центральной нервной системы (ЦНС) путем адаптивного переноса T-клеток, специфичных к аквапорину 4, и мониторинге последующих эффектов в ЦНС и динамической зрительной системе. Этот метод поможет ответить на ключевые вопросы о роли T-клеток, специфичных к аквапорину 4 (общеизвестному как AQP4), при нейромиелите оптического и других воспалительных заболеваниях зрительного аппарата. Основным преимуществом оптической когерентной томографии является возможность неинвазивного лонгитюдного мониторинга повреждений сетчатки.

Процедуру продемонстрируют Шерон Саган, научный сотрудник моей лаборатории, и Андреас Крус Харанс, стипендиат лаборатории Р. Э. Гринса. Начните с присоединения трехходового нейлонового крана с двумя разъемами Luer lock «папа» к стеклянному шприцу с разъемом Luer lock без поршня. Переключите рычаг крана в сторону шприца, чтобы закрыть его, и установите шприц открытым концом вверх.

После перемешивания на вортексе добавьте в шприц равные объемы пептида и раствора полного адъюванта Фрейнда, затем снова вставьте стеклянный поршень в шприц. Удерживая поршень на месте, переверните шприц краником вверх и переключите рычаг на неиспользуемое соединение «мама». Осторожно нажмите на поршень, чтобы удалить из шприца излишки воздуха.

Раствор заполнит второе соединение «папа» Luer lock трехходового крана. Затем присоедините второй стеклянный шприц с полностью введенным поршнем ко второму соединению «папа» Luer lock. Для создания эмульсии поочередно нажимайте на поршни, перенося раствор из одного шприца в другой в течение примерно двух минут, после чего охлаждайте раствор около 10 минут до появления видимого изменения его вязкости.

При образовании очень густой белой эмульсии перенесите весь раствор в один из шприцев, а пустой шприц замените новым шприцем с Luer lock объемом 1 мл. Заполните новый шприц эмульсией. Отсоедините шприц от крана и установите иглу калибра 25G.

Чтобы проверить консистенцию эмульсии с помощью водного теста, выдавите каплю эмульсии в небольшое блюдце с водой. Если эмульсия не рассеивается, она пригодна для инъекции. Затем введите эмульсию каждой мыши-донору с нокаутом AQP4 подкожно однократно в каждую сторону нижней части живота и в каждую сторону грудной стенки медиально по отношению к подмышечной впадине.

Через 10–12 дней после иммунизации сделайте срединный разрез кожи от паха до шеи, а также вдоль каждой задней конечности первой мыши. Оттяните кожу от брюшины и плотно закрепите ее на доске. Затем извлеките паховые и подмышечные лимфатические узлы и поместите ткани в клеточный фильтр в чашке Петри с полной средой.

После сбора всех лимфатических узлов поместите клеточный фильтр на коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую свежую полную среду на льду, и с помощью плоского конца поршня стерильного шприца объемом 5 мл прижмите клетки лимфатических узлов через сетку фильтра. Промойте сетку 20–30 мл полной среды для облегчения извлечения клеток, после чего проведите две центрифужные промывки. После второго центрифугирования ресуспендируйте осадок в среде для Т-клеток для подсчета.

Добавьте в культуру клеток соответствующие концентрации антигена, рекомбинантного интерлейкина 23 мыши и рекомбинантного IL-6 мыши, затем распределите по 2 мл клеток в этой поляризующей смеси Th17 в каждую лунку 12-луночного планшета. Поместите планшет в увлажненный инкубатор при 37 °C и 5% CO2 на 72 часа. На третий день поляризации несколько раз тритурируйте культуры в каждой лунке, чтобы отделить поляризованные клетки, и соберите их в коническую пробирку объемом 50 мл на льду для подсчета.

После двух промывок в PBS разведите клетки в PBS до концентрации 1 × 10⁸ клеток/мл и аккуратно перемешайте клеточную суспензию круговыми движениями. В течение одного часа после сбора перенесите клетки в шприц объемом 1 мл и введите 200 µL суспензии клеток каждому животному-реципиенту внутривенно через хвостовую вену. Затем введите каждой мыши внутрибрюшинно непосредственно в день процедуры и через два дня 200 нг B-пертуссин-токсина, разведенного в 200 µL PBS.

Для проведения оптической когерентной томографии сетчатки реципиентных животных in vivo за пять минут до начала визуализации расширьте зрачки, закапав в каждый глаз по одной капле 1% тропикамида, и включите нагревательный мат. Поместите мышь на цилиндр для визуализации и соответствующим образом перенаправьте поток анестетика. Для увлажнения глаз и обеспечения непрерывности рефракции используйте 0,3% гидроксипропилметилцеллюлозу, после чего установите на исследуемый глаз специальную контактную линзу.

Ориентируясь по инфракрасному изображению глазного дна, направьте лазер на глаз, закрытый контактной линзой, следя за тем, чтобы луч был центрирован по диску зрительного нерва. Выполните 25 B-сканов в режиме высокого разрешения, растрируя изображения из 30 усредненных A-сканов. После получения изображений обоих глаз замените контактную линзу офтальмологическим гелем и поместите мышь в теплую клетку для восстановления.

Для анализа полученных изображений с помощью модульного программного обеспечения для визуализации и автоматической сегментации сначала вручную скорректируйте сегменты, соответствующие внутренней пограничной мембране и внутреннему плексиформному слою, чтобы они отображали границы внутренних слоев сетчатки. Затем убедитесь, что слой нервных волокон сетчатки и слой ганглиозных клеток находятся в пределах внутреннего слоя сетчатки и не перекрывают друг друга. Подкожная иммунизация пептидами AQP4, содержащими патогенные Т-клеточные эпитопы, вызывает сильный пролиферативный Т-клеточный ответ в дренирующих лимфатических узлах мышей с нокаутом AQP4 по сравнению с Т-клеточным ответом мышей дикого типа.

Проточный цитометрический анализ экспрессии отдельных V-бета цепей показывает, что T-клетки, специфичные к пептидам AQP4, содержащим патогенные T-клеточные эпитопы, используют уникальные репертуары TCR и демонстрируют селективную гиперпролиферацию, что указывает на то, что патогенные T-клеточные ответы на эти детерминанты в норме регулируются тимическим отрицательным отбором. Примерно через шесть-девять дней после инъекции поляризованных T-клеток почти у всех мышей-реципиентов развились клинические признаки аутоиммунного заболевания ЦНС, включая вялый хвост и паралич задних конечностей. При этом Th17-поляризованные AQP4-специфичные T-клетки вызывали более тяжелое клиническое течение заболевания, чем Th1-поляризованные AQP4-специфичные T-клетки.

Например, у этой мыши развился полный паралич задних конечностей после введения Th17-поляризованных T-клеток, специфичных к пептиду AQP4. Клиническое заболевание, вызванное AQP4-специфическими Th17-клетками, также сопровождается инфильтрацией мононуклеарных клеток в паренхиму ЦНС и мозговые оболочки, а также воспалением зрительного нерва, что дополнительно подтверждается отеком и увеличением толщины внутреннего слоя сетчатки, которые возвращаются к исходным значениям по мере выздоровления мышей. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как индуцировать и контролировать AQP4-таргетный аутоиммунитет, что позволит проводить дальнейшие исследования для понимания того, как T-клетки участвуют в развитии заболевания нейромиелит зрительного нерва.