Протокол иммунопреципитации (чип) Chromatin для Low изобилие эмбриональных образцов

Общая цель этой процедуры заключается в исследовании профилей связывания различных модификаций гистонов с использованием образцов эмбрионов с низким содержанием с целью улучшения функциональной аннотации геномов позвоночных. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии развития, такие как какие являются ключевыми энхансерами и генами, определяющими идентичность конкретной эмбриональной ткани. Основные преимущества этого метода заключаются в том, что он требует ограниченного количества конкретного материала, а также может быть использован как для локального специфического, так и для полногеномного анализа.

Хотя этот метод может дать представление о регуляции транскрипции или клеточной гетерогенности с эмбриональными тканями, он также может быть применен к другим системам, таким как патентованные образцы. Для получения стадии HH19 куриные эмбрионы для этого эксперимента инкубируют оплодотворенные белые яйца курицы породы Леггорн в горизонтальной ориентации при температуре 37 градусов Цельсия и влажности 80% в течение трех дней. Чтобы начать выделение эмбрионов HH19, сделайте их доступными, экстрагируя три миллилитра альбумина с помощью 10-миллиметрового шприца для опускания бластодермы.

Чтобы удалить лишние эмбриональные оболочки, используйте тонкие ножницы, чтобы сделать небольшое отверстие в глазу. Добавьте один миллилитр раствора для замка. С помощью согнутой иглы добавьте 0,5 миллилитра индийских черных чернил.

С помощью тонких хирургических ножниц и щипцов отрежьте лишнюю эмбриональную оболочку, которая окружает эмбрион. Затем перенесите эмбрион с помощью перфорированной ложки в чашку Петри диаметром 4,5 сантиметра, содержащую 20 миллилитров раствора PBS. Работая на льду под стереомикроскопом, используйте тонкие ножницы и щипцы для препарирования и удаления амниона и оставшихся частей дополнительной эмбриональной мембраны.

Затем разрежьте поперечную спинномозговую нервную трубку или сегмент SNT на плечевом уровне эмбриона. Расширьте диссекцию каудально в грудной отдел, чтобы изолировать SNT. В завершение с помощью щипцов удалите ткани, которые окружают SNT с бокового и вентрального направления.

После выделения СНТ погрузите каждый сегмент в чашку Петри с температурой 3,5 сантиметра, содержащую теплый трипсин при температуре 37 градусов Цельсия. Когда ослабление ненейроактивных тканей вокруг СНТ видно под стереомикроскопом, перенесите образцы в холодный 1х ПБС. Чтобы остановить трипсинизацию, переложите образцы в новую чашку с холодным DMEM, содержащим 10% FBS.

С помощью щипцов вручную удалите оставшиеся мезенхимальные и эктодермальные ткани из СНТ. Переложите эту чистую секцию SNT в пробирку объемом 1,5 миллилитра и мгновенно заморозьте ее в жидком азоте. Далее гомогенизируйте ткань в соответствии с текстовым протоколом.

Добавьте 13,5 микролитров 37% формальдегида и инкубируйте при комнатной температуре на ротаторе в течение 15 минут. Чтобы погасить формальдегид, добавьте в пробирку 25 микролитров 2,5 молярного глицина и выдерживайте при комнатной температуре на ротаторе в течение 10 минут. Центрифугируйте пробирку, а затем промойте гранулу в соответствии с текстовым протоколом.

После сшивания повторно суспендируйте гранулу в 300 микролитрах ледяной жидкости, завершите лизис буфера пипетированием. Инкубируйте образцы при температуре четыре градуса Цельсия на качающейся платформе в течение 10 минут. Затем обработайте образцы ультразвуком при температуре четыре градуса Цельсия.

После ультразвуковой обработки образцы центрифугируют при температуре 16 000 x G при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Перелейте надосадочную жидкость или лизат в свежую 1,5-миллилитровую пробирку и выбросьте гранулу клеточного мусора. Разведите лизат согласно текстовому протоколу.

Затем сохраните небольшую аликвоту каждого образца в качестве входного контроля и заморозьте при температуре 20 градусов Цельсия. Инкубируйте оставшиеся образцы, которые будут подвергнуты осаждению хроматина или чипу с соответствующими антителами согласно текстовому протоколу. Затем добавьте 300 микролитров связанного с антителами хроматина в предварительно промытые магнитные шарики.

Переверните пробирки, чтобы перемешать образцы. Чтобы связать антитела с шариками, поместите пробирки на вращатель трубок и вращайте их вертикально со скоростью четыре градуса Цельсия в течение как минимум четырех часов. Чтобы промыть связанные с хроматином шарики, добавьте один миллилитр ледяного буфера для промывки RIPA в тюбик, который находится на льду, и перемешайте, перевернув или перевернув тюбик.

Поместив трубку в магнитный держатель при комнатной температуре, подождите, пока бусины осядут на сторону. Слейте прозрачную жидкость и повторите эту стирку еще три раза. Добавив в пробирку один миллилитр TE 50 миллимолярного хлорида натрия, перенесите связанные в этом растворе гранулы хроматина в свежую микроцентрифужную пробирку диаметром 1,5 миллиметра.

Поместите трубку в магнитный держатель и, когда шарики осядут, слейте жидкость. Затем центрифугируйте шарики при температуре 900 x G при четырех градусах Цельсия в течение трех минут в предварительно охлажденной центрифуге. После того как шарики уложатся в магнитный держатель, удалите все остатки TE с помощью насадки для загрузки геля.

Работая при комнатной температуре, добавьте в шарики 210 микролитров элюирующего буфера и повторно суспензируйте путем перелистывания. Инкубируйте трубку в предварительно нагретом термоблоке при температуре 65 градусов Цельсия в течение 15 минут, одновременно встряхивая. После инкубации пробирки с шариками центрифугируют при температуре 16 000 x G при комнатной температуре в течение одной минуты.

Как только шарики осядут в магнитном держателе, перенесите надосадочную жидкость в свежую микроцентрифужную пробирку. Разморозьте ранее замороженный входной контрольный образец с 20 градусов Цельсия до комнатной температуры. Добавьте в образец 90 микролитров элюирующего буфера и перемешайте путем кратковременного вортексирования.

Чтобы обратить сшивку, инкубируйте чип и контрольные образцы при температуре 65 градусов Цельсия в течение ночи. Работая при комнатной температуре, добавьте один объем TE буфера на пробирку и переверните для смешивания. Чтобы расщепить РНК, добавьте РНКазу А в контрольные образцы и образцы чипа до конечной концентрации 0,2 миллиграмма на миллилитр и переверните пробирки для перемешивания.

Инкубируйте пробирки в предварительно нагретом тепловом блоке при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух часов. Чтобы переварить белок для последующей очистки ДНК, добавьте в пробирки протеазу К до конечной концентрации 0,2 миллиграмм на миллилитр и переверните пробирки для перемешивания. Инкубируйте трубки в предварительно нагретом тепловом блоке при температуре 55 градусов Цельсия в течение двух часов.

Извлеките и очистите ДНК в соответствии с дополнительными материалами. Теперь эта ДНК может быть использована для количественной ПЦР и подготовки библиотеки чипов. Эффективность ультразвука, необходимая для успешного создания чипа, подтверждается электрофорезом в агарозном геле входных контрольных образцов.

В этом примере с использованием отрезков спинномозговой нервной трубки цыплят или СНТ было использовано 11 циклов ультразвука для получения оптимального размера фрагмента в диапазоне от 200 до 500 пар оснований. Чипированную ДНК анализировали с помощью количественной ПЦР для измерения уровней обогащения активирующих и репрессивных гистоновых меток вокруг промоторных областей генов, которые являются активными и неактивными в SNT курицы. Это показывает, что можно оценить качество скола, количественно оценив только несколько низких сторон, не теряя при этом много ДНК для дальнейшего анализа.

После того, как библиотеки поиска чипов были подготовлены последовательно, показана репрезентативная саранча для данных триметилирования H3K27 и данных поиска чипа триметилирования H3K4, сгенерированных в SNT курицы. Аналогичные профили поиска чипов также были успешно сгенерированы в различных эмбриональных тканях курицы, таких как верхнечелюстные выступы и эмбрионы стадии HH3. Это демонстрирует, что представленный здесь протокол чипа может быть использован для создания эпигеномных профилей из ограниченного количества различных эмбриональных тканей.

Используя этот протокол для создания профилей модификации гистонов в эмбриональной ткани, важно помнить, что сигналы будут поступать от всех различных типов клеток, присутствующих в такой ткани. Следуя этому протоколу и используя большее количество исходного биологического материала, должно быть возможно исследовать профили связывания других белков, участвующих в регуляции транскрипции, таких как факторы транскрипции, коактиваторы или субъединицы РНК-полимеразы 2. Как только эти протоколы будут созданы, они позволят исследователям в области биологии развития или медицинской генетики улучшить функциональное изменение геномов позвоночных и получить важную информацию о молекулярных основах миогенеза, эволюции и болезней человека.