Протокол твердофазного синтеза олигомеров РНК, содержащий 2'- O -тиофенилметильная модификация и характеризация с помощью циркулярного дихроизма

Общая цель данного доклада — проиллюстрировать процедуру получения олигонуклеотидов РНК методом твердофазного синтеза. В качестве моделей будут синтезированы додекамеры РНК, а также будет продемонстрирована их очистка и характеризация. Благодаря своей визуальной составляющей, эта публикация расширит рамки используемых методологий и средств для исследователей в различных областях.

Предоставление наглядного пособия вместе с небольшим протоколом позволит исследователям использовать эти методы. Одним из преимуществ этой техники является ее податливость к широкому спектру модификаций. Поскольку современные приложения становятся все более требовательными, важно иметь стандартный протокол.

Химия фосфорамидитов переживает возрождение благодаря надежности метода и его потенциалу для получения олигонуклеотидов для терапевтического применения. В то время как покупка олигонуклеотидов привлекательна, цена и доступность модификаций смещают интерес к получению этих олигомеров собственными силами, что делает эту процедуру чрезвычайно важной. Чтобы начать эту процедуру, взвесьте каждый фосфорамидит в высушенные в духовке 10-миллилитровые янтарные бутылки и закупорьте каждую бутылку перегородкой, предварительно перфорированной иглой 20-го калибра.

Немедленно поместите бутылки под вакуум с помощью эксикатора, содержащего осушитель. После заполнения эксикатора сухим аргоном извлеките каждую бутылку и немедленно добавьте безводный ацетонитрил перед закреплением на твердофазном пептидном синтезаторе. Затем удалите перегородки из каждой бутылки и поместите ее на синтезатор с помощью функции замены бутылок.

Чтобы настроить твердофазный синтез, выберите значок программы. Выберите название синтезатора и нажмите OK. Затем создайте новый синтез, выбрав «Файл» и «Новый порядок синтеза». После этого используйте окно приглашения, чтобы ввести дату выполнения, клиента и идентификатор выполнения.Выберите инструмент, имя последовательности и последовательность.

На вкладке Цикл назначьте ранее созданный метод. Затем выберите руководство по конечной процедуре, в котором олигонуклеотид останется связанным со смолой CPG. Выберите DMT Off (Выкл.).

Сохраните файл, выбрав Файл и Сохранить как.Затем, укажите имя эксперимента и нажмите кнопку Сохранить. Затем отправьте файл для начала синтеза, выбрав Order и Send Order to Synthesizer. В окне подсказки выберите положение столбца и нажмите OK. В окне Синтезатор выберите Trityl Monitor.

Нажмите на «Выбрать функцию» и «Тритил мониторить» на каждом шаге, набрав 1. Начните синтез, выбрав Синтезатор и Подготовьтесь к началу. Расположите колонны с нужным тройным простым концом в местах, указанных на приборе.

Затем нажмите «Пуск» и «Нет» на приборе. Как только синтез будет завершен, снимите колонку с инструмента и поместите ее в колбу с круглым дном. Просушите колонку при пониженном давлении около 0,5 часов.

Переложите белую смолу из колонки в 1,6-миллилитровую центрифужную пробирку, и добавьте 0,5 миллилитра водного раствора метиламина и аммиака. Закрепите крышку пробирки центрифуги парапленкой, и нагрейте содержимое до 60 градусов Цельсия в течение полутора часов. Поместите тяжелый предмет на верхнюю часть пробирок, чтобы концентрация оставалась постоянной.

После охлаждения до комнатной температуры кратковременно центрифугируйте образец, чтобы раскрутить содержимое. Затем перенесите надосадочную жидкость в новую центрифужную пробирку. Охладите трубку до 70 градусов Цельсия, поместив ее в ванну с этанолом с сухим льдом на пять минут, а затем сконцентрируйте до полного высыхания с помощью скоростного вакуумного концентратора.

Теперь повторно суспендируйте твердые вещества в 0,4 миллилитрах раствора амина тригидрафторида, а затем закрепите крышку лабораторной пленкой. Нагрейте раствор до 60 градусов Цельсия в течение полутора часов. Положите на пробирки тяжелый предмет, чтобы обеспечить постоянную концентрацию.

После охлаждения раствора до комнатной температуры добавьте 0,04 миллилитра раствора ацетата натрия с последующим аккуратным перемешиванием наконечником пипетки. Добавьте один миллилитр этанола и охладите раствор примерно до 70 градусов Цельсия с помощью ванны с сухим льдом в течение 15 минут. После этого центрифугируйте раствор при 15 000 об/мин при четырех градусах Цельсия в течение десяти минут.

С помощью пипетки извлечь надосадочную жидкость и высушить полученную гранулу при пониженном давлении. После сушки полученный твердый и загрузочный буфер снова суспендировать, и перемешать до тех пор, пока раствор не станет однородным. Затем загрузите суспензию на заранее приготовленный полиакриламидный гель.

Наносите ток через гель до тех пор, пока синий маркер брометимола не будет расположен на расстоянии от половины до двух третей вниз по гелю. После снятия геля с подставки перенесите содержимое геля из стекла в полиэтиленовую пленку и поместите на тонкослойную хроматографическую пластину, покрытую диоксидом кремния, для визуализации полос с помощью УФ-лампы. Маркером обозначьте положение, где находится верхняя полоса, и разрежьте ее с помощью лезвия бритвы.

Поместите гель, содержащий РНК, в 50-миллилитровую коническую пробирку, и измельчите ее на мелкие кусочки с помощью стеклянного стержня. Теперь суспензируйте остатки геля в водный раствор хлорида натрия и встряхните суспензию при температуре 37 градусов Цельсия в течение 12 часов. Переложите суспензию в 15-миллилитровую пробирку, а затем центрифугируйте при 3400 об/мин в течение десяти минут.

Чтобы обессолить образец с помощью картриджа с обратной фазой C18, сначала промойте картридж ацетонитрилом, водой, хлоридом водного аммония и раствором РНК, оставив остатки геля. После промывки водой вымывайте РНК из колонки, используя три миллилитра 60% водного раствора метанола, в три разные пробирки. Охладите пробирки до 70 градусов Цельсия на бане с сухим льдом в течение пяти минут, а затем сконцентрируйте содержимое до сухости с помощью скоростного вакуумного концентратора.

После концентрирования элюанта при пониженном давлении повторно растворите остаток в 0,3 миллилитрах воды, не содержащей РНКазы. После разбавления раствора нанесите один микролитр на прибор для измерения УФ-видимого спектра от 200 до 450 нанометров. Для анализа MALDI-TOF сначала промойте наконечник пипетки C18 50% ацетонитрила.

Уравновесьте наконечник пипетки 0,1% трифторуксусной кислотой. Затем загрузите наконечник пипетки раствором, содержащим от 100 до 150 пикомолев образца. Промыв наконечник пипетки 0,1% ТФК и водой, разбавьте образец раствором, содержащим нужную матрицу.

Нанесите 0,9 микролитра раствора на планшет MALDI и дайте образцу высохнуть. Для анализа структуры РНК необходимо перенести образец, содержащий РНК, в микрокювету и поместить его в устройство смены образцов круглого прибора для дихроизма. Откройте резервуар с азотом, чтобы обеспечить поток, который перемещает воздушный поплавок, расположенный на приборе, примерно на 40 градусов.

Затем включите кулер. Теперь включите прибор. Откройте программное обеспечение, щелкнув значок «Диспетчер спектра», а затем откройте окно «Сбор», нажав на «Измерение спектра».

После продувки прибора азотом получите спектры кругового дихроизма, выбрав Measure and Parameters (Измерение и параметры). На вкладке Общие выберите 200-350 нанометров для сканирования, CD и HT для каналов, 0,1 нанометра для шага данных, 100 нанометров в минуту для скорости сканирования, один нанометр для пропускной способности и пять для количества накоплений. На вкладке «Единица измерения ячейки» выберите 20 градусов Цельсия.

На вкладке Управление выберите Затвор открывается и закрывается автоматически. На вкладке Информация введите имя образца, оператора, концентрацию и растворитель. На вкладке «Данные» перейдите к нужной папке и нажмите «ОК». Получите спектры, нажав на «Измерить» и «Образец измерения».

Наконец, определите положения кювет в устройстве смены образцов с первого по шестой и нажмите OK. Четыре нити РНК были получены с помощью твердофазного синтеза, и после очистки получили от 300 до 700 наномолей каждого олигонуклеотида. Здесь показаны хроматограммы олигонуклеотидов MALDI-TOF. При сравнении полосы на расстоянии 260 нм и канонических и модифицированных олигонуклеотидов не наблюдается существенной разницы в нормализованных ультрафиолетовых спектрах, будь то одноцепочечные образцы или дуплексные структуры.

Однако при измерении их круговых спектров дихроизма наблюдаются незначительные изменения. Кроме того, измерения Tm трех дуплексных структур показали отчетливое значение, которое указывает на дестабилизацию, вызванную включением двух основных othyo фенилметиловых модификаций на одну из цепей. Важно помнить, что выход твердофазного синтеза зависит от чистоты реагента.

Влага будет оказывать негативное влияние на каждом этапе, ведь количество воды должно присутствовать реагентом все время. Представленная методология призвана служить общим ресурсом для ученых. Методика может варьироваться в зависимости от желаемой модификации, доступных приборов или временных ограничений.

Тип химии, используемый в данном документе, представляет собой очень надежную методологию, которая используется с 1980-х годов и до сих пор активно используется как в академических, так и в промышленных условиях. После просмотра этого видео вы сможете выполнять синтез, очистку и характеристику собственных модифицированных или канонических олигонуклеотидов РНК или ДНК. Не забывайте, что работа с необходимыми реагентами может быть опасной, поэтому защитные средства, такие как защитные очки, перчатки и лабораторные халаты, следует носить постоянно.

Со всеми реагентами следует обращаться осторожно и, при необходимости, в вытяжном шкафу.