На основе цитометрии цитотоксичность Assay потока для оценки активности клеток человека NK

Общая цель данной процедуры заключается в оценке цитотоксической активности NK-клеток человека. Этот метод может быть использован для мониторинга состояния пациентов с функциональным или классическим дефицитом NK-клеток. Основными преимуществами данной методики, основанной на проточной цитометрии, являются её чувствительность, воспроизводимость и большая скорость по сравнению со стандартными методами оценки функции NK-клеток, такими как тест с высвобождением радиоактивного хрома.

Данный метод может быть использован для тестирования новых видов терапии, направленной на NK-клетки, а также для проведения ранее недоступного детального многопараметрического проточного цитометрического анализа биологии NK-клеток. Начните с выделения мононуклеарных клеток периферической крови (МНКПК) из образцов цельной крови с помощью центрифугирования в градиенте плотности согласно стандартным протоколам. Использование МНКПК вместо очищенных NK-клеток дает значительные преимущества при работе с клиническими образцами.

Разведите изолированные клетки в полной среде до концентрации 5 × 10⁶ клеток/мл и немедленно осадите целевые клетки K562 путем центрифугирования. Ресуспендируйте 5 × 10⁵ клеток K562 в 500 µL свежей среды с добавлением 1% FBS. Затем пометьте целевые клетки, добавив 500 µL рабочего раствора CFSE, и аккуратно перемешайте клеточную суспензию, пропипетировав ее от трех до пяти раз.

После 10 минут выдержки при 37 °C в защищенном от света месте остановите реакцию мечения, добавив 10 мл полной среды, и инкубируйте в течение 10 минут в темноте при комнатной температуре. По окончании инкубации для остановки реакции соберите клетки путем центрифугирования и ресуспендируйте осадок меченых целевых клеток в 1 мл полной среды для подсчета. Затем разведите клетки свежей полной средой до концентрации 1 × 10⁵ клеток/мл и поместите целевые клетки в увлажненный инкубатор при 37 °C и 5% CO2.

Для успешного проведения анализа минимизируйте стресс клеток-мишеней и протестируйте эффекторные клетки как можно скорее после сбора. В течение 30 минут после маркировки клеток-мишеней маркируйте 96-луночный планшет с U-образным дном для культивирования тканей в соответствии с таблицей. Затем добавьте 100 microliters полной среды в лунки с соотношением эффекторных клеток к клеткам-мишеням 25:1, 12,5:1 и 6,25:1, в лунки только с клетками-мишенями и в лунки только с эффекторными клетками.

Добавьте 100 µL эффекторных клеток в лунки контроля цитотоксичности, а также в лунки с соотношением эффекторных клеток к клеткам-мишеням 50:1 и 25:1. Затем, начиная с лунки с соотношением эффекторных клеток к клеткам-мишеням 25:1, перенесите 100 µL клеток в следующую по порядку лунку с более низкой концентрацией соотношения клеток (так для двух последующих лунок), пропуская лунки, содержащие только клетки-мишени; тщательно перемешивайте содержимое перед каждым переносом клеток. Последние 100 µL клеток добавьте в лунки, содержащие только эффекторные клетки. Добавьте 100 µL 2X рабочего раствора 0,2% Tween в лунки положительного контроля гибели клеток K562 с использованием только Tween.

Добавьте 30 µL рабочего раствора из флакона два в лунки положительного контроля цитотоксичности NK-клеток. Затем добавьте 1 × 10⁵ помеченных таргетных клеток K562 на мл в 100 µL полной среды во все лунки, кроме лунок, содержащих только эффекторные клетки. После посева всех клеток перемешайте содержимое всех лунок с помощью многоканального пипеточного дозатора.

Осадите клетки путем кратковременного центрифугирования и поместите планшет в инкубатор для культур клеток на четыре часа. По окончании инкубации поместите планшет на лед или на охлаждающую платформу и добавьте по 50 µL свежеприготовленного красителя для мертвых клеток в каждую лунку. Затем осторожно перемешайте содержимое всех лунок и проанализируйте клетки методом проточной цитометрии.

Проточный цитометрический анализ окрашивания CFSE и маркеров гибели клеток через четыре часа культивирования при низкой температуре, как было только что продемонстрировано, показывает, что в лунках, содержащих только клетки-мишени, гибель клеток составляет 15% или менее. В лунках, содержащих только эффекторные клетки, сигнал CFSE не обнаруживается, а гибель клеток в этих лунках составляет менее пяти процентов. В то же время гибель клеток в лунках с killing-эффектом клеток-мишеней, опосредованным Tween, обычно превышает 85%. У пациентов с дефектом функции NK-клеток наблюдается снижение киллерной активности при большинстве или всех протестированных соотношениях по сравнению со здоровыми людьми, что свидетельствует о том, что NK-клетки этих пациентов демонстрируют дифференциальное снижение цитотоксичности, которое коррелирует с уменьшением соотношения эффекторных клеток к клеткам-мишеням.

После освоения данной методику можно выполнить за шесть с половиной часов, включая два часа на подготовку и посев, четыре часа инкубации и 30 минут сбора данных. При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости параллельной подготовки клеток-мишеней и эффекторных клеток, чтобы минимизировать временной интервал между подготовкой клеток и началом совместной инкубации. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как измерять цитотоксическую активность NK-клеток человека в отношении флуоресцентно меченных клеток-мишеней с помощью проточной цитометрии.