Точный, высокой пропускной способности анализ роста бактерий

Общая цель данного эксперимента заключается в точном анализе бактериального роста с применением высокопроизводительного метода. С помощью данной процедуры можно одновременно тестировать несколько видов сред или различные штаммы. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области системной биологии и микробиологии, например, о том, какие факторы определяют рост клеток.

Основным преимуществом данного метода является то, что он позволяет исследователям точно оценивать глобальные параметры максимальной скорости роста и максимальной плотности популяции на кривых роста бактериальных клеток. Хотя этот метод позволяет изучить рост E. coli, его также можно применять к другим микроорганизмам, например, для проведения анализа роста и скрининга экологических бактерий.

Для начала поместите на чистый стол пять стерилизованных стеклянных пробирок с силиконовыми резиновыми пробками, пипетки и целевые штаммы. Перед тем как открыть силиконовую резиновую пробку, прокалите горлышко стеклянной пробирки в пламени горелки Бунзена. После открытия пробирки прокалите силиконовую резиновую пробку в пламени, а затем осторожно закройте ею пробирку.

Затем с помощью электронного дозатора и одноразовой серологической пипетки внесите 5 мл среды M63 в одну из стеклянных пробирок и по 4,5 мл M63 в остальные четыре пробирки. Используя наконечник p200, возьмите колонию и инокулируйте ее в стеклянную пробирку, содержащую 5 мл M63. Перемешайте содержимое пробирки на вортексе для приготовления суспензии.

Затем разведите раствор в 10 раз, перенеся 0,5 milliliters этого раствора в одну из четырех пробирок, содержащих 4,5 milliliters M63. Повторите эту процедуру для остальных пробирок. После стерилизации горлышек стеклянных пробирок и силиконовых резиновых пробок закройте пробирки пробками.

Затем поместите пять пробирок в предварительно нагретый встряхивающий инкубатор при 37 °C и встряхивайте при 200 rpm. Инкубируйте культуру в течение ночи или от 10 до 30 часов. После инкубации с помощью p1000 перенесите 1 000 µL M63 в одноразовую кювету.

Поместите одноразовую кювету в спектрофотометр. Запустите программу при фиксированной длине волны 600 нм и измерьте холостую пробу. Перенесите пять стеклянных пробирок из встряхивающего инкубатора в ламинарный шкаф.

Удалите M63 из одноразовой кюветы и с помощью дозатора p1000 добавьте в эту же кювету 1,000 µL культуры. Затем измерьте оптическую плотность клеточной культуры. После этого в микропробирку объемом 1.5 мл добавьте 250 µL стерильного 60% раствора глицерина и 750 µL выбранной клеточной культуры, затем перемешайте путем пипетирования.

Поместите остальные девять микроцентрифужных пробирок в штатив и внесите по 100 µL приготовленной смеси в каждую пробирку. Храните стоковые растворы в морозильнике при температуре -80 °C. Для настройки планшетного ридера сначала откройте программное обеспечение, перейдите в раздел протоколов в диспетчере задач и выберите «создать новый».

Затем выберите стандартный протокол. Откройте раздел процедуры и настройте параметры. Откройте меню установки температуры и выберите «инкубатор включен».

Затем установите температуру на 37 °C, а градиент — на 0 °C. Перед переходом к следующему шагу убедитесь, что предварительный нагрев завершен. Откройте раздел «Start Kinetic» и установите время работы 24 или 48 минут, затем задайте интервал 30 минут или один час.

Откройте меню перемешивания (shake) и установите линейный режим перемешивания (linear). Выберите непрерывное перемешивание (continuous shake) и установите частоту 567 cpm. Затем откройте меню считывания (read), выберите измерение абсорбции (absorbance), режим конечной точки/кинетики (endpoint/kinetic) и монохроматоры.

Установите длину волны на 600. Наконец, нажмите «validate», чтобы подтвердить правильность процедуры, и нажмите «save», чтобы сохранить её как новую программу для последующего использования.

Для записи роста в режиме реального времени добавьте примерно 25 миллилитров M63 в стерилизованный резервуар для реагентов. Затем добавьте 900 мкл M63 в микропробирки для подготовки серийных разведений. Далее добавьте 900 мкл M63 к размороженному глицериновому стоку и перемешайте на вортексе.

Перенесите 100 µL десятикратного разведения в другую микропробирку, содержащую 900 µL M63, и перемешайте на вортексе. Повторяйте этот шаг до достижения необходимого количества разведений. Затем с помощью восьмиканального дозатора заполните лунки по краям стерильного плоского 96-луночного микропланшета 200 µL M63.

Внесите по 200 µL каждого разведенного образца в лунки микропланшета в соответствии со справочной таблицей. Чтобы избежать образования краевых эффектов из-за нагрева и влияния эффективности посева, никогда не используйте крайние лунки микропланшета для ваших образцов; вносите один и тот же образец в несколько лунок, расположенных в разных частях микропланшета. Поместите 96-луночный микропланшет в планшетный ридер.

Откройте «Read Now» и диспетчер задач, затем выберите программу. Нажмите «ОК», чтобы начать измерения. В завершение сохраните запись как новый экспериментальный файл для последующего анализа данных.

Здесь представлен пример справочной таблицы, составленной перед началом эксперимента. Пиктограмма 96-луночного планшета была отрисована в виде таблицы размером 8 на 12 для обозначения расположения инокулированных культурных образцов на планшете. Скорость роста рассчитывается путем применения формулы для всех пар последовательных значений OD600.

Для оценки максимальной скорости роста были рассчитаны среднее значение и стандартное отклонение пяти последовательных скоростей роста. Скорости роста в общей сложности 60 клеточных культур представлены в виде тепловой карты. Градиент от белого к красному цвету указывает на изменение скоростей роста от низких к высоким.

После освоения эта техника может быть выполнена за несколько минут при условии правильного соблюдения последовательности действий. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как подготавливать и загружать образцы в микропланшет для высокоточного измерения роста бактерий в режиме высокого пропускания. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости составления справочной таблицы перед началом эксперимента, чтобы избежать использования клеточных культур с низкой плотностью и обеспечить начало роста клеток в течение 24 часов.

После выполнения данной процедуры могут быть применены другие методы, такие как автоматизация экспериментальных манипуляций и компьютерный анализ, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, о факторах, определяющих размножение и динамику популяции. После своей разработки эта методика открыла новые возможности для исследователей в области системной биологии и микробиологии для изучения фундаментальных принципов роста клеток и оптимизации состава питательных сред.