Создание плотного Transposon вставки библиотеки с использованием бактериальной сопряжения в энтеробактерий штаммов таких как Кишечная палочка или шигеллам Флекснера

Общей целью этой экспериментальной процедуры является создание библиотеки вставки транспозонов высокой плотности в Escherichia coli или Shigella flexneri с использованием бактериальной конъюгации. Этот метод позволяет создавать сотни тысяч уникальных бактериальных мутантов путем случайной геномной вставки транспозона Tn10. Основное преимущество этого метода заключается в том, что перенос плазмы в месте укрытия транспозона осуществляется с помощью бактериальной конъюгации вместо других, менее эффективных методов, таких как электропорация.

Кроме того, сам транспозон Tn10 встраивается в геном с меньшим смещением, чем другие транспозоны. Используя стерильную методику, добавьте один миллилитр ночной культуры донорского штамма в стерильную пробирку Эппендорфа. На пробирке должна быть маркировка, например, буквой D, для донора.

Проделайте то же самое для штамма-реципиента, удалив один миллилитр ночной культуры штамма-реципиента в стерильную пробирку Эппендорфа. Опять же, например, помечено буквой R, для получателя. Центрифугируйте обе пробирки в течение одной минуты при температуре 14 000 раз G при комнатной температуре.

Это можно сделать на настольной центрифуге. Пока центрифуга работает, подготовьте фильтры для конъюгации. С помощью стерильных щипцов поместите нитроцеллюлозный фильтр на этикетированную пластину из агара LB, не содержащую антибиотиков.

В качестве альтернативы, вместо нитроцеллюлозного фильтра можно использовать стерильную промокательную бумагу. Поместите каждый фильтр на отдельную пластину из агара LB, чтобы свести к минимуму загрязнение. Убедитесь, что каждый фильтр размещен на агаровой пластине LB с соответствующей маркировкой.

Сделайте три пластины, каждая из которых содержит фильтр. Один для донорского штамма, один для реципиентного штамма и один для библиотеки. После того, как центрифуга закончит работу, удалите ночные культуры.

Удалите из пробирки eppendorf всю питательную среду, содержащую антибиотики, и выбросьте. Будьте осторожны, чтобы не нарушить и не нарушить палитру бактериальных клеток, но постарайтесь удалить всю питательную среду. Убедитесь, что вы работаете асептически и меняйте наконечники между образцами.

В каждую пробирку Eppendorf добавьте 110 микролитров свежей среды LB без антибиотиков и внесите пипетку вверх и вниз, чтобы повторно суспендировать культуру. Убедитесь, что вы работаете асептически. Проводите пипетирование вверх и вниз несколько раз, чтобы убедиться, что не осталось клеточных комков.

Этот шаг делается для концентрации бактериальной культуры и удаления любых антибиотиков, оставшихся от ночной культуры. С помощью пипетки поместите 50 микролитров концентрированной донорской культуры на фильтр с маркировкой «Донор». Медленно добавьте 50 микролитров в фильтр по каплям.

Проделайте то же самое для штамма-реципиента, добавив 50 микролитров ресуспендированной культуры, концентрированной ресуспендированной культуры на фильтр-реципиент по каплям. Для того, чтобы произошло конъюгирование, и реципиентный, и донорский штаммы добавляются в одну и ту же фильтровальную бумагу, чтобы они находились в тесном физическом контакте. Для этого добавьте по 50 микролитров как донорского, так и реципиентного штамма в один и тот же фильтр на табличке с маркировкой библиотеки.

Поместите эти агаровые пластины, содержащие фильтры, при температуре 37 градусов на шесть часов. Процесс конъюгации происходит в течение шести часов при 37 градусах Цельсия. Во время конъюгации плазмин pJA1 перемещается в штамм-реципиент

После конъюгации бактерии отделяются от фильтра путем вортексинга и индуцируются с помощью одного миллимолярного IPTG. IPTG индуцирует транспозазу, и транспозон, содержащий ген устойчивости к канамицину, случайным образом встраивается в геном штамма-реципиента. Бактерии наносятся на агаровые пластины LB, содержащие канамицин и другой антибиотик, который необходимо выбрать для штамма-реципиента, содержащего транспозон.

Реципиентный штамм является Lambda pir-отрицательным, поэтому плазмин pJA1 теряется. После шести часов роста при температуре 37 градусов Цельсия конъюгация завершена. Извлеките из инкубатора пластины с фильтрами.

С помощью стерильных щипцов удалите фильтр, содержащий отрицательный донорский контроль, с агаровой пластины LB. Постучайте по трубке, чтобы переместить фильтровальную бумагу на дно конического флакона и убедиться, что фильтр полностью погружен в фильтрующий материал LB. Эта пробирка содержит два миллилитра LB среды с IPTG и конечную концентрацию одного миллимолара.

Сделайте трубку вихревой в течение одной минуты, чтобы отделить бактерии от нитроцеллюлозного фильтра. Среда LB должна помутнеть от бактериальных клеток. Повторите то же самое для элемента управления получателя и библиотеки.

После того, как фильтры, содержащие бактериальные клетки, были тщательно обработаны для отделения бактерий от фильтра, бактериальные клетки наносятся на выбранный фильтрующий материал. На этом этапе бактерии помещаются в агаровые пластины LB, содержащие канамицин и другой антибиотик, такой как налидиксиновая кислота. Канамицин используется для отбора клеток-реципиентов, у которых транспозон, содержащий маркер резистентности к канамицину, успешно интегрирован в геном.

Клетки-реципиенты, у которых маркер не интегрирован в геном, отбираются. Другой антибиотик, такой как налидиксовая кислота, используется для отбора против донорского штамма. Используемый здесь донорский штамм чувствителен к налидиксовой кислоте, в то время как реципиентный штамм устойчив к налидиксовой кислоте.

С помощью этого второго антибиотика удается удалить донорский штамм. На этом этапе следует нанести несколько разведений, чтобы определить разведение библиотеки, которое дает много колоний, расположенных на достаточном расстоянии друг от друга. После подсчета и записи количества колоний на всех пластинах, содержащих библиотеку транспозонов, некоторые пользователи могут захотеть объединить библиотеку в одну пробирку.

Сделать это можно с помощью стерильного разбрасывателя. Добавьте один миллилитр среды LB в агаровую пластину LB, содержащую библиотеку транспозонов. После того, как среда будет добавлена на пластину, используйте стерильный разбрасыватель, чтобы соскоблить и отделить бактерии от пластины.

Часто не удается удалить все бактерии с тарелки. Удалите бактериальную суспензию и поместите в коническую жидкость 50 мил или 15 мил. Повторите это для всех тарелок.

После того, как все пластины будут соскоблены, переведите скопившуюся бактериальную суспензию на целую минуту, чтобы разбить любые клеточные скопления. Теперь это и составляет объединенную библиотеку. После роста под углом 37 градусов в течение 18 часов на контрольных пластинах донора или реципиента не должно быть нароста.

Пластины, содержащие библиотеку мутантов, в идеале содержат множество колоний различных размеров. Разные размеры колоний указывают на клонов разной приспособленности и являются хорошим признаком того, что протокол сработал. Создание плотной библиотеки мутагенеза транспозонов у бактерий потенциально выгодно для многих последующих приложений, начиная от открытия генов вирулентности и бактериальных патогенов до изучения основных генов и идентификации сетей генетического взаимодействия.

Все эти последующие приложения основаны на построении плотной библиотеки вставки транспозонов. Представленный здесь метод обеспечивает простую, быструю и недорогую процедуру создания очень плотной библиотеки транспозонов в энтеробактериальных штаммах, таких как E. coli или Shigella flexneri.