Количественная оценка человека Моноцит хемотаксис в пробирке и мышиных лимфоцитов, торговля в естественных условиях

Общие цели этих анализов заключаются в количественной оценке хемотаксиса моноцитов in vitro в режиме реального времени и отслеживании миграции лимфоцитов in vivo. Метод in vitro может помочь ответить на ключевые вопросы в области иммунологии, например, каково влияние сывороточных факторов на хемотаксис иммунных клеток. Основное преимущество метода in vitro заключается в том, что он позволяет проводить количественные и мультиплексные измерения в режиме реального времени.

Метод in vivo может помочь ответить на ключевые вопросы в области иммунологии о том, как конкретные типы клеток мигрируют внутри животного-реципиента. Метод in vivo особенно полезен для количественной оценки миграции нескольких типов клеток в пределах одного и того же животного. Перед началом эксперимента пометьте клетки THP-1 флуоресцентным красителем в 35-миллиметровой чашке для клеточных культур в полной среде при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут.

Пока клетки инкубируются, добавьте 750 микролитров HBSS, буферизованного 25 миллимолярными HEPES и 0,1% BSA в фоновые и положительные контрольные лунки 24-луночного планшета. В экспериментальные и положительные контрольные скважины добавляют соответствующую концентрацию МЦП-1 в воде с добавкой БСА. И в каждую лунку поместите пористые вставки, следя за тем, чтобы выступы вставок совпали с насечками пластины.

Очень важно удалить любые пузырьки из нижних лунок после установки вставок, так как пузырьки будут мешать измерениям флуоресценции. По окончании инкубации переложите меченые клетки в коническую пробирку объемом 15 миллилитров для их сбора методом центрифугирования. И визуально осмотреть полученную гранулу, чтобы подтвердить впитывание красителя.

Затем тщательно вакуумируйте надосадочную жидкость и промойте клетки в бессывороточной среде RPMI-1640 с добавлением 25 миллимолярных HEPES в тех же условиях центрифуги. Суспендируйте гранулу в свежей среде, не содержащей сыворотки, с HEPES для подсчета. И отрегулируйте объем до конечной концентрации от одного до 1,5 умножить на 10 до шести клеток на миллилитр.

Добавьте 250 микролитров ячеек в верхнюю камеру каждой лунки и поместите пластину в считыватель пластин с температурой 37 градусов Цельсия. Затем получите показания флуоресценции нижних камер с интервалом от одной до трех минут при соответствующих длинах волн возбуждения и излучения флуоресценции для красителя. Чтобы подготовить донорские клетки к их адоптивному переносу, сначала соберите всю селезенку у обезболенного самца 8-12-недельной мыши C57 black six в нейлоновый сетчатый фильтр толщиной 40 микрометров в чашке для клеточных культур, содержащей полную среду на льду.

С помощью конца поршня шприца аккуратно промульгрируйте селезенку через сетку. Когда будет получена суспензия одиночных клеток, перенесите клетки в коническую пробирку объемом 15 миллилитров и добавьте четыре объема буфера для лизиса хлорида аммония, чтобы истощить эритроциты. Через пять минут при комнатной температуре соберите клетки центрифугированием и повторно суспендируйте гранулу в полной среде в концентрации от двух до пяти от 10 до семи клеток на миллилитр.

Процедите клетки через новую нейлоновую сетку толщиной 40 микрометров, чтобы удалить остатки клеток. И пометьте один раз по 10 на семь клеток на каждую мышь-реципиента совместимым флуоресцентным красителем с живыми клетками, который будет сохраняться при последующей фиксации в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия. В конце инкубации промойте клетки в четырех объемах HBSS с добавлением HEPES.

И ресуспендируйте гранулу в свежем HBSS плюс HEPES до концентрации от 10 до восьми клеток на миллилитр. Затем кратковременно переведите донорские клетки в вихрь и загрузите их в одномиллилитровый шприц, оснащенный иглой 27 калибра 0,5 дюйма. Поместите находящихся под наркозом 8-12-недельных черных мышей-реципиентов C57 в положение лежа и приложите легкое каудальное давление к коже дорсально к глазу первого животного, в результате чего глазное яблоко слегка выступит.

Направьте иглу медиально для ретроорбитального введения 100 микролитров донорских клеток. Затем постепенно извлеките иглу и поместите мышь в индивидуальную клетку для восстановления с контролем до полного выздоровления. Крайне важно, чтобы животные были надлежащим образом обезболены и чтобы процедура инъекции была хорошо отработана, чтобы обеспечить постоянную доставку клеток между животными и между экспериментами.

В течение 24 часов после усыновленного переноса соберите селезенку в один миллилитр полной среды на каждого реципиента. И создать суспензию одиночных клеток, не содержащую эритроцитов, как только что было продемонстрировано. После подсчета отрегулируйте клеточную суспензию в соотношении от трех до 10-7 клеток на миллилитр в буфере для окрашивания.

И переложите 100 микролитров клеток в отдельные лунки 96 лунок круглой нижней пластины. Окрашивание клеток на интересующие маркеры в соответствии со стандартными протоколами проточного цитометрического анализа. Через 20 минут на защищенном от света льду промойте клетки в 100 микролитрах окрашивающего буфера и повторно суспендируйте гранулы в 200 микролитрах свежего окрашивающего буфера для повторного центрифугирования.

Затем ресуспендируют гранулу в 125 микролитрах свежего окрашивающего буфера и анализируют образцы клеток на проточном цитометре в соответствии со стандартными протоколами. Автоматические флуоресцентные показания для отслеживания миграции ясно демонстрируют индукцию миграции клеток к MCP-1, которая усиливается в присутствии сыворотки. В зависимости от силы миграционного стимула, существует задержка не менее 15 минут до увеличения флуоресцентного сигнала, который может достигать пика и постепенно снижаться по мере того, как клетки переходят в раствор в нижнюю камеру с нижней стороны вкладыша с более высокой скоростью, чем клетки, мигрирующие из верхней камеры.

Если более одной флуоресцентно меченой клеточной популяции адоптивно переносятся, важно количественно оценить относительную долю клеточных популяций в входном материале, чтобы учесть любые вариации при смешивании клеточных популяций. Например, в этом эксперименте соотношение зеленых и оранжевых флуоресцентных клеток составляло 0,97 к одному. Трафик был количественно определен как количество восстановленных меченых клеток, деленное на общее количество восстановленных клеток.

Несмотря на значительные различия в количестве восстановленных клеток у разных животных, для любого конкретного животного соотношение зеленых и оранжевых флуоресцентных клеток обычно примерно одинаково. После освоения техника in vitro может быть завершена за четыре часа, а техника in vivo может быть завершена за шесть часов при правильном выполнении. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о том, что следует избегать образования пузырьков в экспериментальных камерах и стремиться к консистенции во время ретроорбитальной инъекции адоптивно перенесенных клеток.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области иммунологии к изучению хемотаксиса in vitro и in vivo. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как проводить и контролировать анализ хемотаксиса in vitro в режиме реального времени и выделять нативные лимфоциты для их адаптационного переноса и отслеживания их миграции in vivo. Спасибо за просмотр, и удачи в ваших экспериментах.