Метод для получения последовательного ультратонких разделы микроорганизмов в просвечивающей электронной микроскопии

Общая цель данной процедуры — безопасное и простое изготовление серийных ультратонких срезов. Этот метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области клеточной биологии, предоставляя количественную и трехмерную структурную информацию о целой клетке на уровне электронной микроскопии. Основным преимуществом данной техники является то, что серийное ультратонкое срезание может быть выполнено без использования дорогостоящего оборудования, при этом с помощью данного метода можно получить изображения с высоким разрешением.

Для начала данной процедуры очистите поверхность предметного стекла. Затем погрузите одну половину предметного стекла в 1,5% раствор Formvar в верхней колонке аппарата для нанесения Formvar, нагнетая раствор воздухом через трехходовой кран с помощью резиновой груши. Слейте раствор из колонки, открыв трехходовой кран и выпустив воздух для снижения давления.

Затем извлеките предметное стекло из аппарата и высушите его на воздухе для формирования пленки на поверхности стекла. С помощью лезвия бритвы снимите пленку по четырем краям предметного стекла. После того как вы выдохнете на стекло для облегчения отделения пленки, снимите ее, медленно погружая предметное стекло в воду под малым горизонтальным углом.

Затем извлеките пленку Formvar из воды с помощью перфорированной алюминиевой подставки. Чтобы обрезать блок образца с помощью ультразвукового лезвия и бритвы под стереомикроскопом, сначала убедитесь в наличии клеток на поверхности блока, осмотрев кончик блока с помощью светового микроскопа. Затем закрепите блок образца в патроне, а патрон установите на обрезной стол.

Обрежьте блоки до размера 0,7 by 1,0 миллиметров. Если эпоксидная смола слишком твердая, сначала обрежьте блок с помощью ультразвукового лезвия, а затем доведите его до нужного размера, используя лезвие бритвы. Сделайте один надрез (плечо), чтобы отметить направление резания.

Для обрезки блока образца алмазным ножом с помощью микротома установите зажим блока образца в держатель для образцов ультрамикротома. Срежьте поверхность блока алмазным обрезным ножом. Расположите лезвие алмазного ножа параллельно поверхности блока образца и срежьте минимальный слой поверхности, чтобы избежать потери материала образца.

Обрежьте левый край блока с помощью обрезного ножа, повернув предметный столик ножа на 30 градусов влево. Этот край станет верхней стороной образца при серийном срезании. Затем срежьте поверхность блока примерно на 100 microns от левого края образца, повернув предметный столик ножа на 30 градусов вправо.

Этот край станет нижней стороной образца при серийном срезе. Извлеките обрезной нож и поверните блок с образцом на 90 градусов по часовой стрелке. Установите нож для ультратонкого среза на держатель ножа.

Отрегулируйте положение поверхности образца и лезвия ножа так, чтобы они были параллельны друг другу, используя большую часть поверхности образца. Затем наклейте ленту на зажим и держатель зажима микротома, и разрежьте ленту по границе. Извлеките зажим с образцом из микротома и поместите его под стереомикроскоп.

Отрежьте большую часть образца лезвием бритвы, оставив узкую часть, из которой будут получены серийные срезы. Чтобы сделать боковые стороны среза адгезивными, с помощью пастеровской пипетки нанесите около 1 µL 0,5% раствора неопрена на образец, предназначенный для серийного срезания. Затем покройте весь образец раствором неопрена. Сразу же удалите излишки раствора неопрена с помощью кусочка фильтровальной бумаги, приложив его к образцу.

Затем подготовьте три щелевые решетки для сбора серийных срезов. Для этого согните ручки решеток под углом 60 градусов и обработайте решетки 0,5% раствором неопрена. Затем сделайте решетки гидрофильными с помощью тлеющего разряда.

Установите зажим с блоком образца обратно в микротом в то же положение, ориентируясь по заклеенным частям. Это обеспечит идеальную параллельность грани блока и лезвия ножа. Затем подведите нож вплотную к образцу.

После наполнения кюветы для ножа водой накройте микротом пластиковой крышкой для предотвращения воздушных потоков. Начните нарезку образца при толщине среза 200 nanometers. После получения первого среза установите толщину среза 70 nanometers.

Когда количество серийных срезов достигнет 20, установите толщину среза на 10 nanometers. Поскольку микротом не может выполнять срезы толщиной 10 nanometers, новые срезы не появляются, а ранее полученные срезы отделяются от режущей кромки ножа. Затем установите толщину среза на 60 nanometers.

В результате будут получены срезы толщиной 70 нанометров, так как прибор добавит предыдущую толщину в 10 нанометров. Наконец, снова установите толщину среза на 70 нанометров и продолжайте резку до получения срезов длиной 1,8 миллиметра. Чтобы собрать серийные срезы, сначала поместите петлю для захвата срезов на третью группу срезов.

Затем поместите петлю для поднятия поверхности воды на предметный столик микротома. Перемещая стержень и ручку, расположите петлю WSRL непосредственно над серийными срезами. Опустите петлю WSRL на поверхность воды так, чтобы петля охватила срезы.

Опустите петлю, поворачивая винт вниз, чтобы поверхность воды поднялась за счет поверхностного натяжения. Переместите срез в центр петли. Разместите его на вершине водного мениска и отрегулируйте направление среза с помощью волоса.

Подберите группы срезов, коснувшись их чистой щелевой сеткой, удерживаемой пинцетом параллельно поверхности воды. Поместите сетки со срезами вместе с крошечной каплей воды на поддерживающую пленку Formvar. Удалите излишки воды с помощью фильтровальной бумаги.

После полного высыхания срезов осторожно разберите пленку Formvar вокруг сеток и извлеките сетки со срезами. Поместите сетки в паз окрашивающей трубки в правильном порядке и окрасьте срезы уранил-ацетатом и цитратом свинца. Установите пять сеток в многоместный держатель в правильном порядке, ориентируя длинную ось прорези сетки перпендикулярно оси держателя образцов.

Зафиксируйте сетку с помощью фиксаторов для сеток и поместите держатель с образцом в просвечивающий электронный микроскоп. Перейдите к съемке целевых клеток и всех срезов клеток при большом увеличении. Здесь представлено изображение пяти сеток с серийными срезами при малом увеличении.

На одну сетку было нанесено 18–25 срезов. Обратите внимание, что срезы прикреплены друг к другу и имеют одинаковую толщину. Здесь представлены серийные срезы миогенеза перикариона.

На рисунке показаны 12 из 67 полных срезов. Было установлено, что в этой клетке имеется крупный нуклеоид, состоящий из «голых» нитей ДНК с одной нуклеоидной мембраной, а также эндосимбионты, напоминающие бактерии, при отсутствии митохондрий. Таким образом, данный организм представляется промежуточной формой жизни, эволюционирующей от прокариота к эукариоту.

Здесь представлены серийные срезы Escherichia coli. На рисунке показаны 12 полных срезов. Примечательно, что в этой клетке было обнаружено 21 700 рибосом.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как делать серийные ультратонкие срезы. При должном навыке и правильном выполнении эта процедура занимает три часа.