Метод для получения последовательного ультратонких разделы микроорганизмов в просвечивающей электронной микроскопии

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы сделать серийные ультратонкие срезы безопасными и простыми. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области клеточной биологии, предоставляя количественную и трехмерную структурную информацию о всей клетке на электронно-микроскопическом уровне. Основное преимущество этой методики заключается в том, что серийная ультратонкая резка может быть выполнена без дорогостоящего станка, и с помощью этого метода можно получить изображения с высоким разрешением.

Для начала этой процедуры очистите поверхность предметного стекла. Затем опустите одну половину предметного стекла в 1,5%-ный раствор Формвара в верхнюю колонну опорного кинопроизводственного аппарата Формвара, продавливая раствор воздухом через трехсторонний стопорный кран с помощью резинового шарика. Слейте раствор из колонны, открыв трехходовой запорный кран и выпустив воздух для снижения давления.

Затем достаньте предметное стекло из аппарата, и просушите на воздухе, чтобы на поверхности предметного стекла образовалась пленка. Соскребите четыре края пленки на предметном стекле лезвием бритвы. После вдыхания на предметное стекло для облегчения отделения пленки от предметного стекла отплывите от пленки, медленно погрузив предметное стекло в воду под низким горизонтальным углом.

Затем зачерпните пленку Формвар из воды с помощью алюминиевой решетки с отверстиями. Чтобы обрезать блок образца ультразвуковым лезвием для обрезки и лезвием бритвы под стереомикроскопом, сначала убедитесь в наличии клеток на поверхности блока, наблюдая за кончиком блока с помощью светового микроскопа. Затем установите блок образцов в патрон и установите патрон на обрезной столик.

Обрежьте блоки до размера 0,7 на 1,0 миллиметра. Если эпоксидная смола очень твердая, сначала обрежьте коробку с помощью ультразвукового лезвия для обрезки, затем обрежьте блок дальше лезвием бритвы. Разрежьте одно плечо, чтобы отметить направление разреза.

Чтобы обрезать блок образцов алмазным ножом с помощью микротома, установите патрон блока образцов в держатель образца ультрамикротома. Разрежьте поверхность блока алмазным ножом для обрезки. Установите кромку алмазного ножа параллельно поверхности блока образцов и отрежьте минимальное количество поверхности образца, чтобы не потерять ни одного образца.

Разрежьте левый край блока с помощью обрезного ножа, повернув ножевой столик на 30 градусов влево. Этот край становится верхней стороной образца при серийном срезе. Затем разрежьте грань блока на расстоянии около 100 микрон от левого края образца, повернув ножевую ступень на 30 градусов вправо.

Эта кромка становится нижней стороной образца при серийной резке. Снимите обрезной нож и поверните блок образцов на 90 градусов по часовой стрелке. Установите ультратонкий нож для резки в положение ножа.

Отрегулируйте поверхность образца и кромку ножа так, чтобы они были обращены параллельно друг другу, используя большую часть поверхности образца. Далее наклейте скотч на патрон и патронодержатель микротома, и разрежьте скотч по границе. Извлеките патрон для образца из микротома и поместите его под стереомикроскоп.

Отрежьте большую часть образца лезвием бритвы, оставив тонкую часть, из которой будут получены серийные срезы Сделайте боковые срезы слипшимися, с помощью пипетки Пастера капните около одного микролитра 0,5% раствора неопрена на образец, который будет использоваться для серийного среза. Затем накройте весь образец раствором неопрена. Излишки раствора неопрена немедленно впитайте в себя с помощью листа фильтровальной бумаги, положенного рядом с образцом.

Далее подготовьте три щелевые сетки для захвата серийных секций. Для этого согните ручку сетки под углом 60 градусов, а сетки обработайте 0,5% раствором неопрена. Затем делают решетки гидрофильными за счет тлеющего разряда.

Поместите патрон блока образцов обратно в микротом в том же положении, выровняв заклеенные части. Благодаря этому поверхность блока и лезвие ножа остаются идеально параллельными друг другу. Затем поднесите нож вплотную к образцу.

Наполнив лодочку для ножа водой, накройте микротом пластиковой крышкой, чтобы предотвратить поступление воздуха. Начинайте резку образца с толщины сечения 200 нанометров. После того, как первый участок будет вырезан, установите толщину сечения на 70 нанометров.

Когда количество серийных секций достигнет 20, установите толщину секции равной 10 нанометрам. Поскольку микротом не может разрезать срезы толщиной 10 нанометров, новый срез не появляется, а ранее вырезанные срезы отделяются от края ножа. Далее установите толщину сечения равной 60 нанометрам.

Это позволит получить срезы размером 70 нанометров, потому что машина добавит предыдущие 10 нанометров. Наконец, установите толщину сечения обратно на 70 нанометров и продолжайте резку до тех пор, пока не получите срезы длиной 1,8 миллиметра. Чтобы выбрать последовательные секции, сначала поместите петлю удержания секции на третью группу секций.

Затем поместите петлю для поднятия поверхности воды на ножевой стол. Поместите петлю WSRL чуть выше серийных секций, перемещая ее вал и ручку. Опустите петлю WSRL на поверхность воды так, чтобы петля опоясывала секции.

Нажмите на петлю вниз, повернув винт вниз так, чтобы поверхность воды поднималась за счет поверхностного натяжения. Переместите секцию к центру петли. Расположите его на вершине воды и отрегулируйте направление секции с помощью пряди волос.

Подбирайте секционные группы, касаясь их голой щелевой сеткой, которой помогает пинцет и она держится параллельно водной поверхности. Поместите решетки с секциями вместе с крошечной каплей воды на опорную пленку Formvar. Удалите лишнюю воду с помощью фильтровальной бумаги.

После того как срезы полностью высохнут, разорвите пленку Формвар вокруг сеток; и удалите сетки, несущие секции. Установите сетки в паз окрашивающей трубки в нужном порядке, а срезы закрасьте уранилацетатом и цитратом свинца. Установите пять сеток в держателе для нескольких образцов в правильном порядке, ориентируя длинную ось щели сетки перпендикулярно оси держателя образца.

Закрепите сетку фиксаторами сетки и вставьте держатель образца в просвечивающий электронный микроскоп. Продолжайте фотографировать целевые клетки и все участки клеток с большим увеличением. Здесь показано изображение пяти сеток с малым увеличением, которые содержат последовательные секции.

На одной сетке монтировалось 18-25 секций. Обратите внимание, что секции крепятся между собой и имеют одинаковую толщину. Здесь показаны серийные срезы перикарионного миогенеза.

На рисунке показано 12 из 67 полных разделов. Было обнаружено, что эта клетка имеет большой нуклеоид, состоящий из голых волокон ДНК с одной нуклеоидной мембраной и эндосимбионтов, которые напоминают бактерии, но не имеют митохондрий. Таким образом, этот организм, по-видимому, является промежуточной формой жизни, эволюционирующей от прокариот к эукариотам.

Здесь показаны серийные секции кишечной палочки. На рисунке показано 12 полных разделов. Интересно, что в этой клетке было обнаружено 21 700 рибосом.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как делать серийные ультратонкие срезы. После освоения этой техники ее можно сделать за три часа, если она выполнена правильно.