Жить изображений миграции эпителиальных клеток молочной железы после переходных истощение TIP60

Общая цель этой процедуры заключается в наблюдении за влиянием истощения определенных генов, представляющих интерес, на миграцию клеток. Этот метод может помочь нам ответить на ключевые вопросы метастазирования рака, такие как миграция раковых клеток. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет отслеживать динамическую миграцию клеток в режиме реального времени.

Впервые идея этого метода возникла у нас, когда мы наблюдали за изменениями морфологии клеток у пациента с TIP60, супрессором опухолей. Начните с посева одного миллиона эпителиальных клеток молочной железы в три миллилитра питательной среды на 10-сантиметровую чашку. Добавляйте 20 минут инкубированную смесь ШРИНА комнатной температуры по капле в экспериментальную клеточную культуру.

Вручную встряхните обе посуды, чтобы убедиться, что ячейки равномерно распределены, прежде чем поместить их в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия. Через шесть часов замените надосадочную жидкость восемью миллилитрами свежей питательной среды на чашку и верните культуры в инкубатор. На следующее утро замените надосадочную жидкость тремя миллилитрами свежей питательной среды на чашку и добавьте второй участок смеси SIRNA в экспериментальную культуру клеток, как только что было продемонстрировано, встряхивая чашку, чтобы убедиться, что реагенты полностью перемешаны, прежде чем возвращать клетки в инкубатор.

Затем замените надосадочную жидкость восемью миллилитрами свежей питательной среды через шесть часов и инкубируйте культуры в течение ночи. На третий день промойте клетки один раз двумя миллилитрами BPS на тарелку и отделите клетки в обеих тарелках одним миллилитром трипсона ЭДТА на чашку на 20 минут при температуре 37 градусов Цельсия. По окончании инкубации остановите реакцию с четырьмя миллилитрами полной питательной среды на одну тарелку.

Повторно суспендируйте клетки с помощью пипетирования и перенесите клеточные суспензии в отдельные 15-миллилитровые пробирки. Соберите клетки центрифугированием и повторно суспендируйте гранулы в пяти миллилитрах бессывороточной среды на пробирку. После подсчета разбавьте обе клеточные культуры до концентрации 600 000 клеток на миллилитр и добавьте 500 микролитров клеток из каждой культуры в одну лунку 24-луночного планшета для обеспечения 100% конфлюенции.

Когда все клетки будут засеяны, осторожно встряхните планшет вперед и назад и из стороны в сторону, чтобы обеспечить равномерное распределение, и поместите планшет в инкубатор для клеточных культур на 24 часа. Чтобы проверить эффективность нокдауна интересующего гена, соберите оставшиеся клетки в пробирках для сбора с помощью еще одного центрифугирования и выделите РНК из гранул с помощью коммерческого реагента в соответствии с инструкциями производителя для количественной оценки ПЦР в режиме реального времени. На следующее утро, по крайней мере за час до начала визуализации живых клеток, включите микроскоп и контролируйте температуру.

Установите температуру на 37 градусов Цельсия и подачу углекислого газа на 5%Когда камера достигнет 37 градусов Цельсия, используйте фазово-контрастную микроскопию, чтобы подтвердить, что клетки сливаются и полностью прикреплены к дну лунок. Затем с помощью наконечника пипетки объемом 200 микролитров аккуратно процарапайте прямую линию по всей длине центра каждой лунки и аккуратно промойте все лунки пять раз средой, не содержащей сыворотки, чтобы удалить отделившиеся клетки. После последнего мытья добавьте по одному миллилитру свободной сыворотки среды в каждую лунку.

Поместите пластину на предметный столик микроскопа под объектив с 10 степенями и направьте излучаемый свет на окуляры, а не на камеру. Вручную отрегулируйте фокус, чтобы найти каждую рану и клетки вокруг нее. Затем верните излучаемый свет обратно в камеру и используйте систему наблюдения за живыми клетками, чтобы отметить положение ран и установить временные условия.

Визуализируйте клетки за соответствующий период эксперимента, затем откройте первое видео avi в соответствующем программном обеспечении для визуализации и откройте плагин m track j. Нажмите на вкладку «Добавить», чтобы добавить траекторию для отдельных клеток, и выберите одну клетку на кончике инвазивного фронта и одну клетку, которая может мигрировать самостоятельно. Следите за движением выбранных клеток на видео с помощью mtrackJ, чтобы отследить их перемещение.

Затем нажмите на вкладку «Измерить», чтобы измерить расстояние движения ячейки и сохранить видео с треками в формате avi. После истощения TIP60 эпителиальные клетки молочной железы становятся более мезенхимальными по сравнению с контрольными культурируемыми клетками. Действительно, экспрессия TIP60, а также экспрессия молекул адгезии эпителиальных клеток значительно снижается после лечения siTIP60.

С другой стороны, экспрессия специфических эпителиальных генов-драйверов мезенхимального перехода увеличивается при истощении TIP60. Живая визуализация клеточных культур после введения раны демонстрирует более быструю миграцию клеток, обработанных siTIP60, по сравнению с культурами siControl, со значительным увеличением процента мигрирующих клеток, наблюдаемым в ответ на истощение TIP60. Кроме того, клетки siControl движутся как лист, в то время как в культурах siTIP60 наблюдается большее движение одиночных клеток.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как использовать метод визуализации живых клеток для мониторинга динамических изменений миграции клеток.