Активации клеток глии Мюллер в лазерно индуцированным дегенерации сетчатки и регенерации модель в данио рерио

Общая цель этого видео — показать, как отслеживать клеточные изменения in vivo после очагового лазерного повреждения сетчатки у рыбок данио. Эта модель может помочь вам ответить на ключевые вопросы регенерации сетчатки, такие как морфологические изменения, кинетика, а также типы вовлеченных клеток. Основное преимущество этой методики заключается в том, что, вызывая очаговую травму, можно исследовать биологические процессы непосредственно в месте травмы.

Хотя этот метод может дать представление о регенерации сетчатки данио-рерио, он также может быть применен для изучения механизма восстановления на различных животных моделях. Приготовьте исходный раствор анестетика, растворив 400 миллиграммов порошка трикаина в 97,9 миллиметрах воды в баке и 2,1 миллиметра одного моляра TBS. Отрегулируйте pH до 7,0 с помощью одного молярного триса при pH 9.

Чтобы сделать рабочий раствор, разведите стоковый раствор трикаина 1 к 25 в баковой воде и переложите 50 миллилитров в чашку Петри. Затем поместите рыбок данио в раствор анестетика на две-пять минут, пока они не станут неподвижными и не перестанут реагировать на внешние раздражители. Переложите каждую рыбку вручную в изготовленный на заказ силиконовый держатель булавки для лазерного лечения.

Надлежащая анестезия имеет решающее значение для благополучия животного и успеха процедуры. Поэтому решающее значение имеет свежеприготовленный раствор трикаина, а время выхода из воды не должно далеко превышать 10 минут. Установите выходную мощность 532-нанометрового лазера на 70 милливатт, длительность импульса на 100 миллисекунд и диаметр антенны на 50 микрон.

Затем нанесите на глаз одну-две капли 2%-ной гидроксипропилметилцеллюлозы. При нанесении метилклетка на глаз следите за тем, чтобы вязкий раствор не попал в жабры. Затем используйте 2-миллиметровую лазерную линзу для фокусировки лазерного луча на сетчатке.

Поместите четыре лазерные точки вокруг зрительного нерва на левом глазу и используйте правый, необработанный глаз в качестве внутреннего контроля. Сразу после индукции лазером поместите все еще находящуюся под наркозом рыбку данио-рерио на изготовленный на заказ силиконовый держатель булавки в области визуализации. Чтобы получить оптимальные изображения, вырежьте имеющуюся в продаже гидрогелевую контактную линзу по размеру глаза данио-рерио с помощью дырокола.

Заполните вогнутую поверхность линзы метилцеллюлозой, затем поместите ее на роговицу. Оснастите систему оптической когерентной томографии объективом с бесконтактной щелевой лампой 78D. Сфокусируйте инфракрасное изображение в режиме ИК плюс ОКТ, чтобы визуализировать глазное дно.

Затем сделайте ИК-снимки, нажав кнопку «Получить», чтобы локализовать лазерные пятна на сетчатке. Затем визуализируйте трехмерный срез слоев сетчатки в режиме ИК плюс ОКТ и сделайте снимки, нажав кнопку «Получить». Обратите внимание на тяжесть повреждения внешнего ядерного слоя на этих изображениях.

Чтобы отменить анестезию после лечения и визуализации, поместите рыбок данио в контейнер с водой в аквариуме. Чтобы ускорить восстановление, создайте поток пресной воды из аквариума над жабрами, перемещая рыбок данио взад и вперед в воде. Сразу после лазерного лечения диффузный гиперрефлективный сигнал был локализован на наружной поверхности сетчатки.

Он распространялся от пигментного эпителия сетчатки к внешнему плексиформному слою. Диффузный гиперрефлективный сигнал отсутствует в сетчатке от контрольного неповрежденного глаза. Аналогичный диффузный гиперрефлективный сигнал обнаружен в первый день после травмы.

После третьего дня этот диффузный сигнал стал более организованным и плотным. Он постоянно наблюдался во внешнем ядерном слое, распространяясь в слой фоторецепторов. По прошествии первой недели наблюдалось значительное уменьшение среднего размера поражения, и был обнаружен лишь небольшой гиперрефлективный сигнал.

Начиная с 14-го дня и до последнего момента исследования, лазерные пятна больше не были видны на ИК- и ОКТ-изображениях, а морфология сетчатки сравнима с контрольной стороной, как показано здесь. Окрашивание H&E было использовано для исследования степени и кинетики дегенерации и регенерации сетчатки. На этом рисунке показана секция управления.

На этом изображении показано окрашивание H&E через три дня после травмы, когда очевидна максимальная потеря фоторецепторов. Была проведена иммуногистохимия для визуализации маркеров глиальных клеток, глутаминсинтетазы красного цвета и глиального фибриллярного кислого белка зеленого цвета. На этом изображении показана контрольная сетчатка, в которой очень слабая зеленая флуоресценция, что указывает на GFAP.

Сигнал GFAP был повышен на третий день после травмы, в то время как сигнал красной глутаминсинтетазы остался неизменным. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как двухфотонная микроскопия, а также клеточный и молекулярный анализ, чтобы изучить участие молекулярных клеток в механизмах эндогенной репарации. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как вызвать очаговое повреждение сетчатки данио-рерио и наблюдать in vivo за следующими дегенеративными и регенеративными процессами.