Подготовка на основе хитозана инъекционные гидрогелей и его применение в культуре клеток 3D

Общая цель этого протокола заключается в приготовлении инъекционного гидрогеля хитозана для трехмерной клеточной культуры, чтобы в конечном итоге использовать его в терапевтических процедурах. Этот метод может ответить на вопросы в области самовосстанавливающегося гидрогеля, например, как сделать самовосстанавливающийся гидрогель путем погружения целиком и как использовать его для 3D-культуры клеток. Преимущество данной методики в том, что совместимый самовосстанавливающийся гидрогель можно получить как очень простым способом, так и с использованием 3D клеточной культуры.

Этот гидрогель также является инъекционным, поэтому его можно использовать в качестве носителя для клеточной терапии. Теперь г-н Юнсан Ли покажет вам, как сделать гидрогель и как сделать 3D-культивирование клеток с использованием этого гидрогеля. Йонгсан Ли – наш аспирант нашей лаборатории.

Чтобы сделать гидрогели, сначала синтезируйте DF PEG. В вытяжном шкафу отвесьте четыре грамма молекулярного веса 4000 ПЭГ в колбу с круглым дном и добавьте 100 миллилитров толуола. Затем, чтобы полимеры растворились, раствор подогреть.

После того, как все полимеры растворятся, используйте испаритель для удаления всех растворителей. Затем повторите процесс смешивания с толуолом и его выпаривания еще дважды, чтобы получить сухие полимеры ПЭГ. Далее с помощью магнитной мешалки и 100 миллилитров ДГФ растворите полимеры.

Затем растворите в растворе 0,9 грамма 4-карбоксибензальдегида. Далее растворите в растворе 0,07 грамма диметиламинопиримида. Теперь добавьте 1,25 грамма DCC в сушильную трубку, наполненную безводным хлоридом кальция.

Теперь дайте реакции помешать при комнатной температуре около 12 часов. На следующий день используйте 500 миллилитров холодного диэтилового эфира для осаждения белых твердых частиц и используйте вакуумную фильтрацию для сбора твердых веществ. Выбросьте растворенное вещество и высушите твердые частицы при хорошей вентиляции.

Далее растворите белые твердые вещества в 100 миллилитрах ТГФ. Любые нерастворимые белые твердые вещества должны быть отфильтрованы перед тем, как продолжить. Теперь осадите растворенные твердые вещества с помощью свежего холодного диэтилового эфира.

Затем используйте вакуумную фильтрацию для сбора твердых частиц и дайте им снова высохнуть. Повторите этот процесс два-три раза, а затем поместите белые твердые вещества в вакуумную сушильную печь, чтобы они полностью высохли. Полученный белый порошок является конечным продуктом: бензальдегидным концевым DF PEG.

Чтобы инкапсулировать клетки в гидрогель для культивирования, сначала растворите 0,44 грамма DF PEG в двух миллилитрах клеточной среды для роста в четырехмиллилитровой пробирке. Перемешайте смесь в 20% раствор по весу. Далее стерилизуем раствор.

Загрузите его в шприц объемом 10 миллилитров и продавите через фильтр для удержания бактерий размером 0,22 микрона. Теперь смешайте 0,165 грамма гликоля-хитозана с четырьмя миллилитрами среды для клеточных культур, используя вихрь, чтобы получить 4% по весу раствор хитозана. Затем стерилизуйте раствор с помощью другого фильтра-антибактериального фильтра размером 0,22 мкм.

Затем соберите клетки, такие как клетки L929, с помощью трипсина. Промойте собранные клетки и повторно суспендируйте их в среде из расчета 3,75 миллиона клеток на миллилитр. На следующем этапе клетки помещаются в 3D-матрицу.

Точное следование этим шагам имеет решающее значение для достижения успеха. Теперь смешайте 0,4 миллилитра клеточной суспензии с 0,4 миллилитрами раствора хитозана с помощью вихря. Нанесите эту смесь в центр чашки Петри диаметром два сантиметра и внесите в чашку 0,2 миллилитра раствора DF PEG.

Затем используйте осторожное пипетирование, чтобы вызвать образование гидрогеля. Оцените образование гидрогеля, наклонив чашку и наблюдая за вязкостью раствора. Чтобы проверить инъекционность инкапсулированных клеток, внесите тот же препарат в 10-миллилитровый шприц.

Затем, после того как гидрогель сформируется, медленно вытолкните гидрогель через иглу 48-го калибра в чашку Петри. Далее добавьте один миллилитр питательной среды в гидрогелево-клеточную смесь в тарелке, и перенесите пластину в инкубатор для культивирования. Через день меняйте среды, накладывая на 3D гидрогелевую культуру клеток.

Чтобы подготовить инкапсулированные в гидрогели клетки к визуализации, сначала промойте гидрогели одним миллилитром PBS два раза. Затем окрасьте гидрогели раствором флуоресцеина-диацетата и раствором йодида пропидиума. Наложите на гидрогель по 0,5 миллилитра обоих растворов и выдержите гидрогель в течение 15 минут при комнатной температуре.

После короткой инкубации с растворами красителя отсасывайте все растворители. Теперь наблюдайте за гидрогелями с помощью конфокальной микроскопии, с возбуждением на 488 нанометрах для просмотра живых клеток и возбуждением на 543 нанометрах для просмотра мертвых клеток. Собирайте стопки изображений с двухмикронными срезами, чтобы проверить распределение клеток в гидрогеле.

L929 клеток. Типичная клеточная линия мышь и стекловолокна с жесткостью тканей in vivo около 5600 Паскалей, была инкапсулирована в гидрогель. Их жизнеспособность была чрезвычайно высокой на протяжении всего процесса культивирования, и они достигли замечательной плотности клеток.

После семи дней культивирования в гидрогеле количество клеток увеличилось на 200%Гидрогели, которые были выброшены на чашку для клеточной культуры через иглу 48-го калибра, могли самовосстанавливаться, превращаясь в интегрированный гидрогель примерно через час. После семи дней культивирования эти клетки также резко размножились. Можно было найти свидетельства деления клеток, в которых некоторые клетки оказывались разделенными на две части.

Анализ «живой-мертвый» показал очень высокую жизнеспособность, продемонстрировав успешную пролиферацию клеток в 3D-гидрогеле после инъекции. Эта скорость пролиферации клеток составляла примерно 3/4 от скорости пролиферации неинъекционных клеток после семи дней культивирования. Таким образом, несмотря на то, что абсолютная сила во время инъекции оказывает ощутимый негативный эффект, введенные клетки все же были довольно пролиферативными.

После просмотра этого видео вы должны знать, как приготовить самовосстанавливающийся гидрогель и как использовать этот гидрогель для 3D клеточной культуры и как доставить клетку с помощью этого гидрогеля. После освоения этой техники ее можно выполнить в течение одного часа, если она выполнена правильно. После наилучшей процедуры может быть выполнен другой метод, такой как инъекция in-vivo для клеточной терапии или доставки лекарств.