Универсальный протокол для крупномасштабных gRNA библиотека производства из любого источника ДНК

Общая цель этого метода заключается в создании всеобъемлющих библиотек направляющих РНК из очищенной ДНК из любого источника. Библиотеки гРНК представляют собой коллекции плазмид, используемые в скринингах на основе CRISPR. Метод CORALINA использует ферментативное расщепление очищенной ДНК для клонирования полученных фрагментов в основу библиотеки направляющей РНК.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что он производит все возможные направляющие РНК из входной последовательности и является очень экономичным. Хотя в этом видео демонстрируется защита библиотеки CORALINA от бактериальной искусственной хромосомы, этот метод в принципе может быть применен к любому типу входной ДНК от любого организма. Оптимизация расщепления микрококковых нуклеаз должна быть выполнена для каждой новой партии микрококковой нуклеазы.

Настройте следующие параметры для каждой реакции. Один микролитр 10-кратного буфера микрококковой нуклеазы, 1 бычий сывороточный альбумин, один микрограмм целевой ДНК, один микролитр микрококковой нуклеазы и вода до 10 микролитров. Выдерживать при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут.

Немедленно инактивируйте фермент, добавив один микролитр 500 миллимолярной EGTA. Добавьте к образцам образцы буфер с гелевым загружающим красителем и загрузите один микрограмм ДНК на лунку в 20% полиакриламидный гель. Загрузите подходящую лестницу ДНК для определения размера.

Запустите гель в 1x TBE в рабочем буфере при напряжении 150 вольт в течение примерно 1,5 часов или до тех пор, пока нижний фронт красителя не достигнет нижнего конца геля. Окрасьте гель с помощью сверхчувствительного красителя нуклеиновой кислоты и визуализируйте под ультрафиолетовым светом. В данном примере оптимальная концентрация микрококковой нуклеазы для расщепления ДНК размером до 20-30 пар оснований составила 10 единиц.

Используйте эту оптимальную концентрацию микрококковой нуклеазы для переваривания от 10 до 12 микрограммов целевой ДНК таким же образом, как это было показано для реакций оптимизации. После разделения фрагментов ДНК по ПЕЙДЖ с помощью стерильного скальпеля разрежьте гель рядом с маркерной полосой и окрасьте только часть геля, содержащую лестницу, свежим 1x TBE беговым буфером, содержащим сверхчувствительный краситель нуклеиновой кислоты. Визуализируйте лестницу ДНК и используйте лезвие бритвы для вырезания фрагментов ДНК, расщепленных микрококковой нуклеазой, в диапазоне размеров от примерно 18 до 30 пар оснований.

Переложите срез геля в микроцентрифужную пробирку. Окрасьте оставшуюся часть геля красителем для нуклеиновых кислот, как показано ранее. Подвергните гель воздействию ультрафиолетового света и получите изображение в виде записи этапа иссечения геля.

Начните эту процедуру с использования стерильного наконечника для пипетки, чтобы раздавить иссеченный срез геля о стенку микроцентрифужной пробирки. Добавьте два объема геля солюбизационного буфера PAGE и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия на вращающейся платформе в течение 16 часов. На следующий день центрифугируйте образец в микроцентрифуге на максимальной скорости в течение одной минуты.

Перенесите надосадочную жидкость в новую микроцентрифужную пробирку, стараясь не перенести измельченные кусочки геля. Добавьте в гранулу геля 0,5 объема солюбилизационного буфера PAGE, сделайте вихрь и повторите центрифугирование. Объедините надосадочную жидкость и извлеките фрагменты ДНК с помощью стандартного метода фенол-хлороформной экстракции, как описано в текстовом протоколе.

Параллельно с выделением фрагментов ДНК амплифицируют линкеры из вектора экспрессии направляющей РНК с помощью стандартной ПЦР. Чтобы обеспечить направленное клонирование, линкеры затем расщепляются соответствующими ферментами рестрикции, как описано в текстовом протоколе. Запустите фермент рестрикции расщепления линкеров на однопроцентном агарозном геле.

Вырежьте правильные полосы и очистите ДНК от вырезанных кусочков геля с помощью набора для экстракции геля. Набор для притупления ДНК используется для реакции восстановления конца. Добавьте в пробирку для микрофуги следующее.

10 микролитров очищенной ДНК, 1,5 микролитра 10-кратного притупляющего буфера, 1,5 микролитра одной миллимолярной смеси dNTP, 1,4 микролитра воды и 0,6 микролитра притупляющего фермента. Инкубируйте при температуре 22 градуса Цельсия в течение 30 минут, а затем нагрейте и активируйте фермент путем инкубации при температуре 70 градусов Цельсия в течение 10 минут. Добавьте 85 микролитров воды и проведите реакционную очистку, как описано в текстовом протоколе.

Настройте реакцию лигирования объемом 14 микролитров с использованием равных молярных количеств микрококковых нуклеаз, расщепленных и репарированных фрагментов и линкерных последовательностей, как описано в текстовом протоколе. После перевода ника продукт лигирования амплифицируют с помощью ПЦР. Чтобы отделить фрагменты микрококковой нуклеазы с правильно присоединенным пятью простыми и тремя простыми линкерами от фрагментов с двумя пятью простыми или двумя трехпростыми линкерами, объедините все 15 циклических ПЦР-реакций, добавьте ДНК-загружающий краситель и запустите 0,8%-ный агарозный гель.

Иссеките выступающую полосу на 869 парах оснований и очистите ДНК с помощью набора для экстракции геля. Количественно оцените количество ДНК с помощью спектрофотометра. Впоследствии клонировать амплифицированные ПЦР фрагменты в вектор экспрессии направляющей РНК методом сборки Гибсона, как описано в текстовом протоколе.

Чтобы начать эту процедуру, аликвотный очищенный вектор вставить конструкцию в стерильные и предварительно охлажденные ПЦР-пробирки и держать на льду. Охладите электропорационные кюветы с зазором в один миллиметр на льду. Добавьте 25 микролитров свежеприготовленных клеток TG1 непосредственно к одной аликвоте ДНК и немедленно перенесите смесь в кювету для электропорации.

Проведите или постучите по кювете, чтобы убедиться, что смесь клеток и ДНК распределена по всей длине кюветной камеры без захваченного воздуха или пузырьков. Поместите кювету в камеру скольжения и запустите соответствующую программу электропорации. Сразу же добавьте в кювету 475 микролитров комнатной температуры 2TY.

Перенесите электропорированные бактерии в 50-миллилитровую трубку. Повторите отдельные электропорации, соберите все клетки, преобразованные с помощью одной библиотеки, в одну 50-миллилитровую пробирку и задокументируйте общий объем. Чтобы оценить общее количество колоний для всей библиотеки, нанесите на пластину определенное небольшое количество бактерий, преобразованных с помощью библиотеки, на 10-сантиметровую агаровую пластину с соответствующим подбором антибиотиков.

Чтобы уменьшить объем остатков бактерий, центрифугируйте при давлении около 4000 г в течение 10 минут или до тех пор, пока не сформируется видимая палитра и надосадочная жидкость не станет прозрачной. Удалите все, кроме нескольких миллилитров надосадочной жидкости, и верните клетки на суспендию. Поместите бактерии на чашки для биоанализа, покрытые агаровым покрытием 2TY, содержащие соответствующий выбор антибиотиков.

Распределите соответствующий объем реакции контрольной электропорации pUC19 на дополнительную 10-сантиметровую агаровую чашку с соответствующим подбором антибиотика. Инкубируйте агаровые пластины при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи. На следующий день подсчитайте количество колоний на контролируемых планшетах, чтобы оценить колониеобразующую единицу на микрограмм ДНК бактерий, а также сложность библиотеки.

Наконец, соскребите бактерии с планшета для извлечения плазмидной ДНК. После очистки гелем 1/6 очищенных фрагментов микрококковой нуклеазы загружали в гель 20%PAGE для подтверждения успешного выбора размера и очистки. Ампликоны линкеров расщепляли с помощью ферментов рестрикции, чтобы обеспечить лигирование линкеров на расщепленные фрагменты микрококковой нуклеазы в правильной ориентации.

В левой части этого репрезентативного изображения геля показаны пять простых и три простых линкера до и после расщепления с HindIII и SacII соответственно, что указывает на полное расщепление линкеров на предиктивные 637 пар оснований и 295 пар оснований. Правая сторона изображения геля документирует иссечение расщепленных фрагментов линкера. Успешное лигирование линкеров к фрагментам ДНК анализировали с помощью ПЦР с увеличенным числом циклов ПЦР.

В состав группы входили элементы управления без шаблона, использующие в качестве входных данных элемент управления без шаблона с предыдущего этапа трансляции ника, и контроль без фрагмента микрококковой нуклеазы. Только в образцах, в которых фрагменты микрококковой нуклеазы были объединены с линкерной ДНК, был получен ожидаемый ампликон из 869 пар оснований. После освоения этой техники ее можно выполнить за пять дней, если она выполнена правильно.

При выполнении этой процедуры важно сохранить сложность библиотеки и выполнить другие реакции управления. После просмотра этого видео вы должны хорошо понять, как создать библиотеку направляющей РНК для экранов на основе CRISPR, разрезав ДНК на мелкие кусочки и клонировав их в векторную основу библиотеки.