Применение лазерной микро облучения для рассмотрения одного и двойной стренги перерыв ремонт в клетках млекопитающих

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы вызвать повреждение ДНК в субъядерной области клетки с помощью лазера для конфокальной флуоресцентной микроскопии. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы репарации ДНК, такие как то, как белки рекрутируются и сохраняются в местах повреждения ДНК. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет визуализировать интересующий белок в режиме реального времени, чтобы можно было построить профиль рекрутинга и удержания.

Начните эту процедуру с помещения предметного стекла в камеру, содержащую интересующие клетки, в инкубатор на верхней ступени, где поддерживается температура 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Регистрация полей изображений с помощью закодированного автоматизированного предметного столика для микроскопа. Выберите узнаваемую особенность сосуда для культивирования, такую как барьер между лунками.

Соберите изображение и запишите местоположение X-Y. Это позволит выровнять и зарегистрировать X-Y местоположения выбранных полей после подготовки образца. После завершения регистрации изображения выберите поле для микрооблучения и сфокусируйте образец.

Для клеток, экспрессирующих флуоресцентно меченные белки, выберите фокальную плоскость с максимальным сечением ядра в интересующем флуоресцентном канале. Сосредоточение внимания на максимальном сечении ядра имеет решающее значение, поскольку это гарантирует, что фокусная точка будет центрирована на ядре для мониторинга рекрутирования интересующего белка в место индуцированного повреждения. Выберите четкую деталь внутри ядра, такую как ядрышко, и перемещайте фокальную плоскость вверх и вниз, наблюдая за этим изменением внешнего вида.

Истинная фокальная плоскость будет лежать внутри перехода от светлого к темному. Чтобы сфокусировать образец, выберите фокальную плоскость, в которой выбранный объект имеет наиболее резкий контраст. Следующим шагом является регистрация позиции интересующей области.

Создайте квадратную область интереса размером три на три пикселя, или ROI, в программном обеспечении микроскопа. Поместите этот ROI на ядро поврежденной клетки и установите этот ROI как ROI поврежденного. Соберите изображение до нанесения урона, включая положение ROI урона.

Получите изображение, содержащее яркое поле в канале флуоресценции для интересующего белка. Теперь клетки готовы к лазерному микрооблучению. Для этой демонстрации будет использоваться 405-нанометровый лазер на 100% мощности.

Доза лазера в 405 нанометров контролируется путем модуляции скорости сканирования и выполнения одного сканирования выбранного ROI повреждений. В этом эксперименте используются восемь и 0,5 кадра в секунду для микрооблучения на 405 нанометрах. Выбор подходящей мощности лазера для повреждения клеток имеет решающее значение для разделения различных путей репарации ДНК.

Выполняйте покадровую съемку светлых полей и каналов флуоресценции после повреждения. Отрегулируйте продолжительность и частоту покадровой съемки для оптимизации сбора данных, идеально фиксируя накопление флуоресцентного белка в момент ROI повреждения и его диссоциацию в течение эксперимента. После того, как временной ход будет завершен, выберите новое поле клеток для повреждения и продолжайте микрооблучение и покадровую визуализацию до тех пор, пока не будет достигнуто желаемое количество поврежденных клеток.

Рекомендуется использовать от 10 до 25 ячеек на выбранное условие. Чтобы увеличить общее количество клеток для иммунофлуоресцентного анализа, повредите дополнительные поля в культуральном сосуде, чтобы создать многопольный временной ход ответа после повреждения. Запишите местоположение каждого поля по осям X-Y и время повреждения.

Клетки могут быть зафиксированы сразу после повреждения или восстановлены в течение выбранного периода времени до фиксации. Чтобы начать этот анализ, откройте полученные изображения в приложении для анализа изображений, таком как NIS-Elements. Для каждой клетки, которую необходимо измерить, сначала сгенерируйте эталонный ROI, представляющий ядро.

Используйте алгоритм порогового значения для сигнала цветения, содержащего пиксели, составляющие ядро, а затем преобразуйте эту область в ROI. Затем создайте ROI размером шесть на шесть пикселей и поместите его поверх ROI урона. Этот больший ROI теперь является ROI ущерба для анализа.

Для каждой измеряемой ячейки запишите среднюю интенсивность цветения для эталонных значений ROI и ROI повреждений. Для каждого кадра временного цикла отрегулируйте эталонный ROI, чтобы убедиться, что ядерная область точно охвачена ROI, и отрегулируйте ROI ущерба, чтобы убедиться, что поврежденное место покрыто. Запишите среднюю интенсивность флуоресценции флуоресцентного сигнала в пределах каждого ROI для каждого кадра временного хода.

Для каждой ячейки нормализуйте среднюю интенсивность флуоресценции ROI повреждения до интенсивности соответствующей эталонной ROI в каждом кадре таймлапса. Здесь в качестве эталонного ROI используется средняя интенсивность ядерной флуоресценции, а нормализация выполняется путем вычитания средней интенсивности флуоресценции референсного ROI от средней интенсивности флуоресценции ROI повреждения. Повторите нормализацию для всех поврежденных клеток, а также как минимум для двух неповрежденных контрольных клеток.

Наконец, на графике нормализованы значения интенсивности с течением времени, чтобы показать изменения в динамике набора в зависимости от экспериментального лечения. Клетки, стабильно экспрессирующие XRCC1-GFP, облучались и визуализировались до и после индукции повреждения. Наблюдалось привлечение XRCC1-GFP к ROI ущерба и измерялась динамика рекрутинга.

Образование двухцепочечных разрывов изучалось с использованием двух маркеров. Для обоих маркеров двухсекундная стимуляция низкими дозами на 355 нанометрах не вызывает ответа через 5 минут и 20 минут, а слабая и вариабельная реакция через 10 минут после облучения. 10-секундное высокодозное микрооблучение на глубине 355 нанометров индуцирует повышенный флуоресцентный сигнал в пределах ROI повреждения через 5, 10 и 20 минут после облучения, который уменьшается через 40 минут.

Эти результаты указывают на то, что двухцепочечные маркеры разрыва ДНК реагируют на 355-нанометровое микрооблучение дозозависимым образом. Напротив, 405-нанометровая лазерная стимуляция привела к значительному накоплению обоих маркеров в пределах ROI повреждения независимо от применяемой дозы. После освоения эта техника может быть выполнена примерно за четыре часа на 10 клетках, если она выполнена правильно.

При выполнении этой техники важно адаптировать длину волны лазера и прилагаемую мощность к контролируемому процессу ремонта. После этой процедуры может быть выполнена иммунофлуоресценция, чтобы ответить на вопросы о рекрутировании дополнительных белков или изменениях в статусе фосфорилирования или других посттрансляционных модификациях. Этот метод позволяет исследователям исследовать динамическое рекрутирование белков репарации ДНК и лучше определить, как белковые домены и мутации влияют на распознавание и реакцию на повреждение ДНК.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как использовать лазерный сканирующий конфокальный микроскоп для индуцирования повреждения ДНК и мониторинга рекрутинга белков репарации ДНК. Не забывайте, что работа с лазерами и химическими веществами, такими как формальдегид, может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует принимать меры предосторожности, такие как средства индивидуальной защиты.