В естественных условиях Отслеживание человека жировой производные мезенхимальных стволовых клеток в мышиной модели артроз колена с красителем липофильных флуоресцентных мембраны

Этот протокол описывает эффективный способ контроля за сохранение клеток и накопление жировой производные мезенхимальных стволовых клеток человека (haMSCs) far-red флуоресценции маркировки в мышиной модели коленного остеоартрита (КОА) через Внутрисуставных инъекций (IA).

Общая цель этой процедуры заключается в оценке эффективности персистенции клеток и биораспределения мезенхимальных стволовых клеток, полученных из жировой ткани человека, при остеоартрите коленного сустава крысы или модели КОА, с использованием флуоресцентной визуализации in vivo. Отслеживание стволовых клеток in vivo может помочь ответить на ключевой вопрос в области регенеративной математики о раздражении и распределении жировой ткани человека, полученной в мезенхимальных стволовых клетках на животных моделях KOA. Основное преимущество использования DiD заключается в том, что его смещенный спектр излучения позволяет визуализировать глубокие ткани живых животных без цитотических эффектов или функционального повреждения клеток, меченных красителем.

Начните с того, что поместите обезболенного самца крысы Sprague Dawley весом от 250 до 300 граммов весом от 8 до 12 недель в левое боковое положение на подогреваемую подушку. С помощью бритвы тщательно выбрите правое колено, а операционную область продезинфицируйте 10% раствором повидон-йода и 70% этанолом. Накройте неоперационную область хирургической прокладкой.

И с помощью скальпеля сделайте двухсантиметровый разрез сбоку вдоль сухожилия надколенника, чтобы обнажить капсулы сустава. Затем с помощью хирургического скальпеля пересеките медиальную коллатеральную связку, отражая мениск в сторону бедренной кости, и захватите медиальный мениск щипцами. Используйте скальпель, чтобы разрезать мениск в самом узком месте от места крепления большеберцовой кости.

Для получения надежного и возможного начала КОА у каждого подопытного животного следует полностью перерезать бедренную сторону мениска. Затем закройте капсулу сустава видимым швом «четыре О» и наблюдайте за крысой до полного выздоровления. Через восемь недель после операции отделите мезенхимальные клетки, полученные из жировой ткани человека, от 80% конфлюентной культуры с двумя миллилитрами трипсина плюс ЭДТА в течение трех минут при температуре 37 градусов Цельсия.

Через несколько минут нейтрализуйте трипсин четырьмя миллилитрами полной питательной среды и соберите клетки центрифугированием. Ресуспендируйте гранулу в соотношении от 10 до 10 до шестой клетки на миллилитр в пяти миллилитрах бессывороточной питательной среды. И пометьте клетки 50 микролитрами раствора для мечения клеток DiD в течение 50 минут при температуре 37 градусов Цельсия.

В конце инкубации соберите клетки центрифугированием и промойте их два раза по пять миллилитров PBS за одну промывку. После последнего центрифугирования разбавьте клетки до соотношения в 2,5 раза от 10 до шестой жизнеспособных клеток на 100 микролитров концентрации PBS и загрузите клетки в одномиллилитровый шприц, оснащенный иглой 26 калибра. Затем повторно побрейте пораженное артритом колено первого подопытного животного, чтобы обнажить область сустава, и продезинфицируйте открытую кожу 70% этанолом.

Введите помеченные клетки в центр треугольника, образованного медиальной стороной надколенника, медиальным мыщелком бедренной кости и медиальным мыщелком большеберцовой кости, и откройте программное обеспечение для визуализации. Инициализируйте систему биолюминесцентной визуализации in vivo и расположите животных в положении лежа на спине в центральном сценарии системы визуализации. При закрытой дверце камеры проверьте флуоресцентный бокс и выберите подходящие комплекты возбуждающих и эмиссионных флуоресцентных фильтров.

Установите поле зрения на D, угол изгиба пикселя на восемь, диафрагму F на два, а время экспозиции на авто. После получения снимков дайте животным восстановиться на грелке с контролем до полного выздоровления. Затем в соответствующем программном обеспечении для анализа изображений выберите единицы эффективности излучения для измерения флуоресценции и области интереса для анализа, а также количественно оцените флуоресцентные сигналы от каждого изображения.

В этом репрезентативном эксперименте серийные срезы коленного сустава крысы, вызванной остеоартритом коленного сустава, были оценены с помощью H&E и окрашивания сафранином O/Fast Green через восемь недель после операции. Толщина суставного хряща в коленных суставах, пораженных артритом, меньше, чем в контралатеральных суставах без хирургического вмешательства, что наблюдается на участках, окрашенных H&E. Кроме того, в артритном суставе уменьшается протеогликан и увеличивается фибриллированный коллаген, что визуализируется с помощью окрашивания сафранином O/Fast Green, что указывает на прогрессирование фенотипа дегенеративного остеоартрита коленного сустава, вызванного операцией.

Через час после окрашивания меченые DiD мезенхимальные клетки человека, полученные из жировой ткани, демонстрируют круглую форму in vitro. Через 24 часа культивируемые мезенхимальные клетки, меченные DiD, демонстрируют длинную веретенообразную форму, подтверждающую, что DiD не изменяет адгезионную способность клеток. Визуализация коленных суставов животных с остеоартритом через восемь недель после операции показывает наличие меченых DiD клеток с нулевого дня до 70-го дня после инъекции.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области терапии стволовыми клетками к определению оптимальной процедуры и дозировки для безопасной и осуществимой инъекции мезенхимальных стволовых клеток для лечения остеоартрита коленного сустава у животных. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как помечать мезенхимальные стволовые клетки человека DiD для инъекции и отслеживания in vivo в модели КОА крысы, вызванной хирургическим путем.