Быстрое, режиссер дифференциация клеток эпителия сетчатки пигмента от человеческого эмбриона или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

Общая цель данного метода заключается в эффективном направлении дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в клетки пигментного эпителия сетчатки в однородном слое. Этот метод помогает ответить на вопросы в области исследований сетчатки и глаза, например, как развивается сетчатка и как создать модель заболевания стволовыми клетками. Основное преимущество этой методики в том, что она быстрее и эффективнее спонтанных методов.

Этот метод использует комбинацию факторов роста и малых молекул для управления дифференцировкой стволовых клеток, чтобы стать незрелым РПЭ через 14 дней и зрелым функциональным РПЭ через три месяца. Части процедуры будет демонстрировать Кэссиди Арнольд, заместитель директора лаборатории биологии и инженерии стволовых клеток в Калифорнийском университете в Санта-Барбаре. Чтобы начать эту процедуру, вырастите колонии стволовых клеток в условиях без питания и сыворотки примерно до 80% конфлюенции перед пассированием.

Затем покройте 12-луночный планшет гидрогелем на основе внеклеточного матрикса в соответствии с рекомендациями производителя и дайте ему застыть в течение одного часа при комнатной температуре или на ночь при температуре четыре градуса Цельсия. После этого аликвотируйте объем дифференцировочных сред сетчатки и ПБС без кальция или магния необходимо для нулевого дня и прогрейте их на водяной бане до 37 градусов Цельсия. Далее добавьте факторы роста в прогретый RDM и доведите ЭДТА до комнатной температуры.

При необходимости удалите все дифференцированные колонии с помощью наконечника пипетки P10 на основе морфологии из стволовых клеток, которые будут проходить для дифференцировки. Фибробластические клетки между колониями, а также непрозрачные клетки внутри колоний указывают на дифференцированные клетки, подлежащие удалению. Ручное удаление клеток является одним из наиболее важных этапов протокола, потому что начало работы с полностью недифференцированной популяцией стволовых клеток позволит обеспечить более эффективное обогащение.

Затем пропустите одну лунку шестилуночного планшета в четыре лунки 12-луночного планшета путем аспирации среды из стволовых клеток и однократной промывки лунок двумя миллилитрами предварительно подогретого PBS. После этого аспирируйте PBS и промойте каждую лунку три раза одним миллилитром ЭДТА на лунку. Затем аккуратно наклоните пластину и аспирируйте ЭДТА.

Ни в коем случае не взбалтывайте пластину, чтобы избежать преждевременного подъема клеток. После третьей стирки снова добавьте один миллилитр ЭДТА и выдержите пластину при комнатной температуре в вытяжке в течение трех-пяти минут. Не тревожьте пластину во время такой инкубации.

После этого отсадите ЭДТА и добавьте один миллилитр RDM на лунку, в которую будет помещено, плюс 0,5 миллилитра дополнительной среды. Например, промойте одну лунку шестилуночного планшета 4,5 миллилитровыми РСДМ на четыре лунки 12-луночного планшета. Затем с помощью скребка для клеток аккуратно отделите клетки.

Измельчите клетки в RDM путем пятикратного пипетирования вверх и вниз в лунке и быстро завершите этот этап, чтобы предотвратить повторное прикрепление к планшету. Поместите в коническую трубочку. Диссоциируйте большие скопления клеток, но не растирайте до одноклеточной суспензии.

Равномерно распределите ячейки в пипетке и быстро выполните этот шаг, чтобы предотвратить повторное прикрепление к пластине. При желании используйте световой микроскоп, чтобы наблюдать за размером скоплений клеток. Затем засейте клетки на 12-луночные планшеты с покрытием ECM.

Наклоняйте планшет вперед и назад, чтобы равномерно распределить клетки по лункам, и поместите его в инкубатор для клеточных культур при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2 до следующей смены среды. В этой процедуре на шестилуночный планшет наносят ECM со сниженным фактором роста в соответствии с рекомендациями производителя. Дайте ему застыть в течение часа при комнатной температуре на ночь при температуре четыре градуса Цельсия.

Затем укажите необходимое количество DPBS и один миллилитр RDM на лунку обогащения и прогрейте их до 37 градусов Цельсия на водяной бане. Доведите трипсиноподобный фермент до комнатной температуры и нагрейте необходимое количество поддерживающей среды RPE до 37 градусов Цельсия. После этого добавьте антимикробный реагент и ингибитор ROCK в RSM для достижения конечной концентрации 0,5x антимикробного и 10 микромолярного ингибитора ROCK.

Используйте эту среду в течение первых четырех-семи дней для улучшения привязанности. Далее отсасывайте отработанную среду из всех лунок и добавляйте по одному миллилитру на лунку предварительно прогретой РДМ без факторов роста. При необходимости препарируйте и соскребите все клетки, не относящиеся к РПЭ, с помощью наконечника для пипетки P10 под препарирующим микроскопом.

После вскрытия аспирируйте RDM и весь клеточный мусор и дважды промойте их одним миллилитром предварительно подогретого DPBS на лунку. Впоследствии добавьте 0,5 миллилитра TDE в лунку 12-луночного планшета и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут. После этого с помощью скребка для клеток аккуратно удалите клетки с пластины.

Осторожно растирайте клеточную ферментную суспензию, пипетируя вверх и вниз три-четыре раза, чтобы создать однородную суспензию. Далее разведите суспензию клеточного фермента в соотношении один к 10 в предварительно подогретом RSM без ингибитора ROCK. Центрифугируйте клеточную суспензию при 173г в течение пяти минут при комнатной температуре.

Через пять минут аспирируйте среду из клеточной гранулы и ресуспендируйте клетки в RSM с помощью 10 микромолярного ингибитора ROCK. Далее процедите клетки с помощью сетчатого фильтра из нейлоновой сетки с порами 40 микрометров. Посчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра и рассчитайте концентрацию клеток в процеженном растворе.

После этого засейте клетки с уменьшенным фактором роста, покрытыми ECM-покрытием планшеты в соотношении от 10 до 5 клеток на квадратный сантиметр в четырех миллилитрах RSM с 10 микромолярным ингибитором ROCK. Замените RSM 10 микромолярным ингибитором ROCK через 48 часов после посева клеток и продолжайте заменять среду каждые три-четыре дня. Прекратите добавление ингибитора ROCK в RSM через четыре-семь дней.

Дайте клеткам созреть в течение 28-35 дней при 37 градусах Цельсия и 5% CO2 и продолжайте заменять RSM каждые три-четыре дня. Здесь показаны индуцированные плюрипотентные стволовые клетки непосредственно перед пассингом для дифференцировки. Стволовые клетки малы и плотно упакованы в колониях, которые, по-видимому, не содержат дифференцированных клеток, таких как фибробласты между или непрозрачные проходы внутри колоний.

Вот незрелые клетки РПЭ на второй день. Клетки на этом этапе все еще должны быть субсливающимися и расширяющимися проекциями в пустые пространства между клетками. Эти клетки находятся перед сбором для снятия обогащения на 14 день.

Клетки, не относящиеся к РПЭ, проявляются в виде патчей или непрозрачных лент. Круглый участок содержит клетки с фибробластической морфологией, в то время как непрозрачные участки считаются нервной сетчаткой. На этих изображениях показан РПЭ на нулевом, первом и третьем проходах на 30-й день.

При каждом пассаже клетки должны сливаться и, по-видимому, иметь признаки морфологии пигментированного эпителия сетчатки, включая фазовые границы и многоугольную форму. После освоения техники пассирования и обогащения могут быть завершены за один-два часа в зависимости от масштаба клеточной культуры. После этой процедуры можно использовать такие методы, как количественная оценка генов или белков и функциональные анализы, чтобы ответить на вопросы о способности РПЭ секретировать факторы роста или фагоцитозные внешние сегменты.

В статьях, опубликованных Дэйвом Бухгольцем в 2013 году и Линдси Личем в 2015 году, подробно описывается разработка и оптимизация этого метода. Мы предоставили подробную и тщательную демонстрацию каждого шага процедуры, чтобы сделать ее легко доступной для исследователей в этой области. Удачных экспериментов.