Быстрое, режиссер дифференциация клеток эпителия сетчатки пигмента от человеческого эмбриона или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

Общая цель данного метода заключается в эффективном направлении дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в однородный слой эпителиальных клеток ретинального пигмента. Этот метод помогает ответить на вопросы в области исследований сетчатки и глаз, такие как механизмы развития сетчатки и способы создания моделей заболеваний на основе стволовых клеток. Основным преимуществом данной техники является то, что она более быстрая и эффективная, чем спонтанные методы.

В данном методе используется комбинация факторов роста и малых молекул для направленной дифференцировки стволовых клеток в незрелый РПЭ через 14 дней и в зрелый функциональный РПЭ через три месяца. Части процедуры продемонстрирует Кэссиди Арнольд, заместитель директора лаборатории биологии и инженерии стволовых клеток в UC Santa Barbara. Для начала данной процедуры вырастите колонии стволовых клеток в бессывороточных условиях без использования фидерного слоя до достижения примерно 80% конфлюэнтности перед пассированием.

Затем покройте планшет на 12 лунок гидрогелем на основе внеклеточного матрикса согласно рекомендациям производителя и дайте ему застыть в течение одного часа при комнатной температуре или в течение ночи при температуре 4 °C. После этого отмерьте объем среды для дифференцировки сетчатки и PBS без кальция и магния, необходимые для нулевого дня, и прогрейте их на водяной бане до 37 °C. Затем добавьте факторы роста в прогретую RDM и доведите EDTA до комнатной температуры.

При необходимости удалите все дифференцированные колонии с помощью наконечника дозатора P10, основываясь на морфологии, из популяции стволовых клеток, предназначенных для пассирования перед дифференцировкой. Фибробластоподобные клетки между колониями, а также непрозрачные клетки внутри колоний указывают на дифференцированные клетки, которые следует удалить. Ручное удаление клеток является одним из наиболее критических этапов протокола, поскольку использование полностью недифференцированной популяции стволовых клеток обеспечит более эффективное обогащение.

Затем перенесите содержимое одной лунки планшета на шесть лунок в четыре лунки 12-луночного планшета, предварительно аспирировав среду из стволовых клеток и один раз промыв лунки двумя миллилитрами предварительно нагретого PBS. После этого аспирируйте PBS и трижды промойте каждую лунку одним миллилитром EDTA на лунку. Затем аккуратно наклоните планшет и аспирируйте EDTA.

Не встряхивайте планшет, чтобы избежать преждевременного открепления клеток. После третьего промывания снова добавьте один миллилитр EDTA и инкубируйте планшет при комнатной температуре в вытяжном шкафу от трех до пяти минут. Не перемещайте планшет во время этой инкубации.

После этого аспирируйте ЭДТА и добавьте по одному миллилитру RDM на каждую лунку, в которую будут высе быть клетки, плюс 0,5 миллилитра дополнительной среды. Например, промойте одну лунку планшета на шесть лунок 4,5 миллилитрами RDM для последующего посева в четыре лунки планшета на 12 лунок. Затем с помощью скрейпера для клеток осторожно отделите клетки от поверхности.

Разотрите клетки в RDM, пять раз прокачав их пипеткой вверх и вниз в лунке; выполните этот шаг быстро, чтобы предотвратить повторное прикрепление клеток к планшету. Перенесите их в коническую пробирку. Разобщите крупные скопления клеток, но не доводите до получения суспензии одиночных клеток.

Равномерно распределите клетки в пипетке и выполните этот этап быстро, чтобы предотвратить их повторное прикрепление к планшету. При желании используйте световой микроскоп для оценки размера клеточных агрегатов. Затем высейте клетки на 12-луночные планшеты, покрытые ECM.

Наклоняйте планшет вперед и назад, чтобы равномерно распределить клетки по лункам, и поместите его в инкубатор для культур клеток при 37 °C и 5% CO2 до следующей смены среды. В данной процедуре покройте шестилуночный планшет внеклеточным матриксом (ECM) с пониженным содержанием факторов роста согласно рекомендациям производителя. Дайте ему застыть в течение одного часа при комнатной температуре или в течение ночи при 4 °C.

Затем разлейте по лункам для обогащения необходимый объем DPBS и по 1 мл RDM, после чего подогрейте их в водяной бане до 37 °C. Доведите трипсин-подобный фермент до комнатной температуры и подогрейте необходимый объем поддерживающей среды RPE до 37 °C. После этого добавьте в RSM антимикробный реагент и ингибитор ROCK, чтобы достичь конечной концентрации 0,5х антимикробного реагента и 10 µM ингибитора ROCK.

Используйте эту среду в течение первых четырех-семи дней для улучшения прикрепления клеток. Затем аспирируйте отработанную среду из всех лунок и добавьте в каждую лунку по одному миллилитру предварительно подогретого RDM без факторов роста. При необходимости удалите все клетки, не относящиеся к RPE, путем диссекции и соскабливания с помощью наконечника дозатора P10 под диссекционным микроскопом.

После диссекции аспирируйте RDM и все клеточный дебрис, затем дважды промойте их одним миллилитром предварительно нагретого DPBS на лунку. Затем добавьте по 0,5 миллилитра TDE в каждую лунку 12-луночного планшета и инкубируйте при 37 °C в течение пяти минут. После этого с помощью скребка для клеток осторожно удалите клетки с планшета.

Осторожно гомогенизируйте суспензию клеток с ферментом, несколько раз (три-четыре) прокачав её через пипетку до получения однородной суспензии. Затем разведите суспензию клеток с ферментом в соотношении 1:10 в предварительно нагретой среде RSM без ингибитора ROCK. Центрифугируйте клеточную суспензию при 173g в течение пяти минут при комнатной температуре.

Через пять минут удалите аспирацией среду из осадка клеток и ресуспендируйте клетки в RSM с 10 µM ингибитора ROCK. Затем профильтруйте клетки через нейлоновый сеточный фильтр с размером пор 40 µm. Подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра и вычислите концентрацию клеток в профильтрованном растворе.

После этого высейте клетки на пластины с покрытием из внеклеточного матрикса (ECM) со сниженным содержанием факторов роста в концентрации 1 × 10⁵ клеток на квадратный сантиметр в 4 мл RSM с 10 мкМ ингибитора ROCK. Замените RSM с 10 мкМ ингибитором ROCK через 48 часов после высева клеток и продолжайте заменять среду каждые три-четыре дня. Прекратите добавление ингибитора ROCK в RSM через четыре-семь дней.

Дайте клеткам созреть в течение 28–35 дней при 37 °C и 5% CO2, продолжая заменять RSM каждые три-четыре дня. Здесь представлены индуцированные плюрипотентные стволовые клетки непосредственно перед пассажированием для дифференцировки. Стволовые клетки мелкие и плотно упакованы в колонии, которые, по всей видимости, не содержат дифференцированных клеток, таких как фибробласты между колониями или непрозрачные участки внутри них.

На представленном изображении показаны незрелые клетки РПЭ на второй день. На данном этапе клетки должны оставаться субконфлюэнтными и иметь отростки, выходящие в свободные пространства между клетками. Эти клетки еще не подвергались отбору для удаления примесей, который проводится на 14-й день.

Клетки, не относящиеся к РПЭ, выглядят как пятна или непрозрачные ленты. Круглые пятна состоят из клеток с фибробластической морфологией, тогда как непрозрачные пятна, по всей видимости, представляют собой нейроретину. На этих изображениях показан РПЭ на нулевом, первом и третьем пассажах на 30-й день.

При каждом пассаже клетки должны быть конфлюэнтными и проявлять характерные признаки морфологии ретинального пигментного эпителия, включая фазово-светлые границы и полигональную форму. После освоения методики процедуры пассирования и обогащения могут быть выполнены за один-два часа в зависимости от масштаба клеточной культуры. После выполнения данной процедуры для ответа на вопросы о способности RPE секретировать факторы роста или фагоцитировать наружные сегменты могут быть использованы такие методы, как количественное определение генов или белков, а также функциональные анализы.

В статьях, опубликованных Дейвом Буххольцем в 2013 году и Линдсей Лич в 2015 году, подробно описываются разработка и оптимизация этого метода. Мы представили детальную и исчерпывающую демонстрацию каждого этапа процедуры, чтобы сделать ее доступной для исследователей в данной области. Желаем успехов в экспериментах.