Строительство и оценке модели мышиных подвздошную остеолиза под воздействием CoCrMo частиц в асептических рыхления

Общая цель данной процедуры заключается в создании и оценке модели остеолиза свода черепа мыши путем воздействия наночастиц кобальта-хрома-молибдена. Остеолиз, вызванный продуктами износа, является основной причиной асептического расшатывания при неудаче артропластики, однако лежащие в основе этого процесса механизмы остаются неясными. Из-за длительного периода наблюдения и спорадического возникновения данной патологии изучение патогенеза асептического расшатывания в клинических случаях затруднительно.

Следовательно, для дальнейшего изучения необходима модель износа на животных. В нашей лаборатории модель остеолиза черепной коробки мышей, созданная с помощью частиц кобальтового сплава, является эффективной моделью для изучения патогенеза асептического расшатывания. Это достигается путем первоначального получения наноразмерных частиц кобальт-хром-молибдена из протеза из кобальтового сплава и их последующего ресуспендирования в фосфатно-солевом буферном растворе в концентрации 15 mg/mL.

Следующим шагом является определение места разреза по линии, соединяющей две средние точки между глазами и ушами соответственно. Затем удалите надкостницу черепа с кальварии методом шоковой диссекции. После этого возьмите 50 µL стокового раствора наночастиц кобальтового сплава и введите их в средний шов кальварии.

После двух недель содержания принесите в жертву нескольких мышей и соберите теменные кости (calvaria) для оценки остеолиза. Остеолиз отчетливо виден у мышей, подвергнутых воздействию наночастиц кобальтового сплава, как на снимках микро-КТ, так и на изображениях при окрашивании гематоксилином и эозином (H and E). Получите сплав кобальт-хром-молибден из протеза из кобальтового сплава, выделив частицы кобальт-хром-молибдена из сплава кобальт-хром-молибден с помощью созданной трехэлектродной установки постоянного тока в глубоком вакууме.

Для определения среднего диаметра частиц кобальт-хром-молибдена поместите 1 mg частиц в 1.5 mL безводного этанола и суспендируйте их с помощью ультразвуковой обработки. Нанесите одну каплю суспензии объемом около 20 µL на предметный столик просвечивающего электронного микроскопа и получите серию изображений. Используйте прилагаемое программное обеспечение для расчета среднего диаметра и распределения частиц по размерам на ПЭМ-изображениях.

На левой панели представлены репрезентативные ПЭМ-изображения, а на правой — распределение частиц по размеру для сплава кобальт-хром-молибден, рассчитанное с помощью нашего коммерческого программного обеспечения. Средний диаметр составляет около 50 нанометров. Автоклавируйте частицы в течение 15 минут для удаления эндотоксинов.

Затем ресуспендируйте их в фосфатно-солевом буфере с концентрацией 15 mg/mL для получения стокового раствора. Следующим этапом является создание модели остеолиза свода черепа. Выберите и анестезируйте мышей в возрасте шести недель: по шесть мышей в каждой группе.

Поместите животных в исходное положение. Удалите шерсть и продезинфицируйте кожу в области черепа 75% этанолом. Для выполнения разреза определите две средние точки между глазами и ушами соответственно и надрежьте кожу по линии, соединяющей их.

Осторожно и полностью удалите надкостницу черепа с свода черепа методом шоковой диссекции. Тщательное отделение надкостницы усиливает взаимодействие между частицами в своде черепа. На обоих концах разреза аккуратно накладывают простые раздельные швы.

Обычно для полного наложения швов требуется три стежка. На заключительном этапе, удерживая оба конца шовной нити, проведите ее через разрез без завязывания узла. Возьмите 15 µL основного раствора наночастиц кобальтового сплава и имплантируйте их в область среднего шва свода черепа.

Завяжите последний шов при наложении простых прерывистых швов. Содержите мышей еще в течение двух недель. Через две недели подвергните животное эвтаназии и извлеките теменные кости.

Осторожно удалите все мягкие ткани с образцов свода черепа с помощью пинцета и зафиксируйте ткань в 4% параформальдегиде при температуре 4 °C. Для оценки остеолиза в модели, индуцированной наночастицами кобальт-хром-молибдена, проведите микро-КТ высокого разрешения за 24 часа до основного микро-КТ сканирования. Перенесите образцы свода черепа из параформальдегида в фосфатно-солевой буферный раствор.

В день микро-КТ сканирования извлеките образцы свода черепа из фосфатно-солевого буферного раствора и закрепите их в держателе соответствующего прибора. Выполните сканирование свода черепа на микро-КТ установке. Проведите трехмерную реконструкцию с помощью специализированного программного обеспечения.

Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) является еще одним инструментом оценки остеолиза в модели, индуцированной наночастицами. Декальцинируйте образцы свода черепа в фосфатно-солевом буферном растворе, содержащем 15% этилендиаминтетрауксусной кислоты, в течение трех недель при температуре 4 °C. Залейте декальцинированный свод черепа в парафин и изготовьте срезы толщиной 2 мкм в области осаждения частиц.

Окрасьте срезы гематоксилином и эозином. Изучите общую морфологию при помощи световой микроскопии и получите микрофотографии. Ниже представлены репрезентативные изображения микро-КТ.

На левой панели представлены изображения трехмерной реконструкции данных микро-КТ. На правой панели показаны изображения поперечных срезов контрольной группы, группы с ложной операцией и группы мышей, получавших наночастицы. В группе с применением наночастиц отчетливо наблюдается остеолиз.

Ниже представлен количественный анализ снимков микро-КТ, выполненный с помощью соответствующего программного обеспечения. Измерения включают минеральную плотность костной ткани, отношение объема костной ткани к общему объему, процент общей пористости, количество трабекул, толщину трабекул, а также расстояние или интервал между трабекулами. У мышей, получавших наночастицы кобальтового сплава, наблюдаются значительно более низкие показатели минеральной плотности и объема костной ткани при более высоком проценте общей пористости по сравнению с контрольными животными.

Ниже представлены репрезентативные изображения окрашивания гематоксилином и эозином (H and E) образцов свода черепа мышей контрольной группы, группы ложной операции и группы, получавшей наночастицы. В группе лечения наночастицами также отчетливо наблюдается остеолиз. Модель остеолиза свода черепа мыши, созданная с помощью наночастиц кобальтового сплава, обладает высоким процентом успеха в моделировании остеолиза, индуцированного частицами износа.

Ниже приведены несколько ключевых факторов. Во-первых, наночастицы кобальтового сплава усиливают взаимодействие между частицами износа и сводом черепа. Во-вторых, достаточное обнажение свода черепа и тщательное иссечение надкостницы делают взаимодействие между частицами и сводом черепа более интенсивным.

В-третьих, количественная оценка потери костной ткани с помощью микро-КТ упрощает анализ различий в степени резорбции кости при различных вариантах лечения, предоставляя более убедительные доказательства остеолиза по сравнению с традиционной гистоморфометрией кости. Модель остеолиза свода черепа, индуцированная частицами кобальтового сплава, является идеальной моделью для изучения взаимодействия между частицами износа и различными клетками при асептическом расшатывании, такими как макрофаги, фибробласты, остеокласты и остеобласты.

Мы надеемся, что наша модель будет полезна для будущих исследований асептического расшатывания.