Количественная оценка Моноцит трансмиграции и образование пены клетки от физических лиц с хронические воспалительные заболевания

Общая цель этого анализа заключается в количественной оценке способности моноцитов из клинических образцов человека к трансэндотелиальной миграции и образованию пенистых клеток. Этот метод может быть использован для ответа на ключевые вопросы в области сердечно-сосудистой системы, такие как атерогенный потенциал клеток людей, которые подвержены риску острой ишемической болезни сердца. Основное преимущество этого метода заключается в том, что клинические образцы могут быть измерены как из свежей цельной крови, так и из хранящихся когорт пациентов.

Кроме того, образование пенистых клеток может быть количественно определено как с помощью микроскопии, так и с помощью проточной цитометрии. Сначала приготовьте полимеризованные гели с коллагеном из свежей суспензии коллагена. В пятимиллилитровую полистирольную трубку добавьте гидроксид натрия, затем в 10 раз М199, затем кислую кислоту и, наконец, добавьте волокнистый коллаген.

Хорошо перемешайте с помощью пипетки. Далее аликвот 50 микролитров во внутренние лунки стерильного плоскодонного 96-луночного планшета для культуры тканей. В наружные края лунок загрузите 200 микролитров одноразового Dulbecco PBS для предотвращения высыхания.

После двух часов инкубации при 37 градусах Цельсия коллаген полимеризуется. Затем посыпьте гели 150 микролитрами однократно дополненного M199 и инкубируйте их до тех пор, пока они не понадобятся для использования через пять дней. Чтобы расширить хранящиеся эндотелиальные клетки пупочной вены человека, приготовьте культуральную колбу площадью 25 квадратных сантиметров с одним миллилитром раствора фибронектина и выдержите чашку в течение 10 минут при комнатной температуре.

Тем временем разморозьте хранящиеся ячейки на водяной бане, чтобы повторно суспендировать их в M20. Как только клетки разморозятся, отсадите остаточный раствор фибронектина из чашки и проложите клетки на пластинах. Затем культура должна слиться путем замены среды через два-три дня.

HUVEC должны слиться на пятый день культивирования. Отделите их, отасунув надосадочную жидкость культуры из колбы, а затем смойте сыворотку, содержащую среду, используя два-три миллилитра одноразового PBS. Затем добавьте пять миллилитров разведенного трипсина и кратковременно инкубируйте клетки при комнатной температуре, осторожно встряхивая клетки до тех пор, пока они не станут казаться отделенными.

Затем быстро соберите их с помощью пятимиллилитров М20 и перенесите суспензию в 10-миллилитровую пробирку и центрифугированные ячейки. Теперь ресуспендируйте клетки в M20 при концентрации 200 000 клеток на миллилитр. Затем аспирируйте M199 из подготовленной коллагеновой пластины и добавьте 100 микролитров HUVEC в каждый гель.

Продолжайте выращивание в течение трех дней. На восьмой день культивирования HUVEC активируйте монослои перед добавлением моноцитов. После отсасывания перекрывающей среды добавьте в каждую лунку по 100 микролитров человеческого раствора TNF-альфа.

Затем инкубируйте пластину при температуре 37 градусов Цельсия в течение четырех часов. После инкубации удалите среду и дважды промойте гели, используя 100 микролитров M199 на одну стирку. Теперь добавьте 50 000 свежевыделенных моноцитов или очищенных субпопуляций моноцитов в 100 микролитрах M20 к монослоям HUVEC.

После добавления моноцитов инкубируйте планшет в течение часа, чтобы обеспечить прямую трансмиграцию клеток. Через час соберите неперевезенные клетки в раствор для промывки. Начните с объединения двух промывок EGTA, используя 100 микролитров на лунку.

Затем уменьшите комбинированные растворы для стирки при температуре 300 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 30 микролитрах PBS и подсчитайте клетки, чтобы определить процент прямых трансмигрирующих клеток. Теперь один раз промойте лунки пластины M199 и добавьте 100 микролитров свежего M20 в лунки для пластин и выдержите пластину в течение двух дней.

Через два дня повторите процедуру сбора нетрансмигрировавших клеток в растворе для промывки EGTA с целью сбора обратно трансмигрировавших клеток и приступайте к фенотипическому анализу клеток. Чтобы фенотипически охарактеризовать гелево-связанные клетки с помощью анализа FACS, расщепите клетки, добавив 100 микролитров коллагенеза D при температуре 37 градусов Цельсия и инкубируйте в течение 20 минут при температуре 37 градусов Цельсия. После инкубации мацерируйте гели с помощью наконечника для пипетки объемом 200 микролитров и инкубируйте их еще 20 минут, чтобы они полностью переварились.

После полного расщепления отфильтруйте и объедините переваренные гели через нейлоновую сетку толщиной 35 микрон в трубку FACS на льду. Теперь один раз промойте отфильтрованные ячейки холодным раствором для промывки FACS. Центрифугируйте клетки и повторно суспендируйте их в 100 микролитрах холодного моющего раствора.

Затем выполните окрашивание и анализ FACS в соответствии с текстовым протоколом. Чтобы проанализировать клетки с помощью микроскопии, сначала окрасьте клетки, как описано в текстовом протоколе. Чтобы отделить окрашенные ячейки, ободьте лунки с помощью иглы 21 калибра фаской наружу.

Далее подготавливаем слайды для крепления гелей. Проделайте два небольших отверстия в полоске двустороннего скотча, а затем закрепите ленту на предметном стеколе и снимите защитное покрытие. Далее добавьте по капле воды в каждое отверстие в ленте.

Затем с помощью пинцета аккуратно перенесите два геля на два отверстия и накройте лентой. Наконец, аккуратно прикрепите покровный лист к ленте и приступайте к визуализации ячеек. После трансмиграции нетрансмиграционные клетки подсчитывались так, как описано.

В общей сложности было восстановлено 15 000 нетрансмигрировавших клеток, и процент прямой трансмиграции составил 95%. После 48 часов дальнейшей инкубации было восстановлено 36 000 обратно трансмигрировавших клеток, что составило 12,6% обратной трансмиграции. Окрашивание гелей масляным красным О выявило пенистые клетки, отмеченные белыми стрелками, и макрофаги, отмеченные черными стрелками. Эти моноциты обрабатывали окисленным ЛПНП во время трансмиграции, веществом, используемым для индуцирования образования пенистых клеток в обычных моделях индукции пенопластовых клеток.

Совокупные данные о количестве клеток от 12 доноров подтвердили, что инкубация моноцитов с окисленными ЛПНП индуцировала большее образование пенистых клеток, чем при инкубации моноцитов только с нативными средами ЛПНП или M199. Трансмигрировавшие клетки также были проанализированы с помощью проточной цитометрии. После исключения мертвых клеток, дублетов и CD45-отрицательных HUVEC была выбрана основная популяция мигрировавших клеток и средняя интенсивность флуоресценции интересующих рецепторов сравнивалась с данными флуоресценции минус один или контрольными данными изотипа.

После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как использовать этот анализ для количественной оценки трансэндотелиальной миграции моноцитов и образования пенистых клеток из клинических образцов человека. Не забывайте, что работа с клиническими образцами человека может быть чрезвычайно опасной, и всегда необходимо использовать хорошую лабораторную технику.