Биохимических и структурных характеристик углеводный транспорта субстрата белок-SP0092

Общей целью этой процедуры является биохимическая и структурная характеристика белка, связывающего углеводный субстрат из Streptococcus pneumoniae. Этот метод может помочь получить ключевые данные для помощи в учебных исследованиях субстрат-связывающего белка, таких как идентификация профилей стабильности буфера, состояний олигомеризации и атомных структур. Преимущества этой процедуры заключаются в том, что она позволяет получить данные, которые могут повысить вероятность успешной кристаллизации и структурного решения для белков, связывающих субстрат, надежным и простым способом.

Сначала приготовьте 48 буферных растворов с диапазоном pH от 4,0 до 9,5 и концентрацией хлорида натрия в диапазоне от нуля до 0,5 моляра. Раздайте по 40 микролитров каждого раствора в 96-луночный планшет. Получите очищенный раствор выбранного белка, связывающего субстрат.

Добавьте пять микролитров раствора СБП в каждую лунку для получения концентрации от одного до двух миллиграммов на миллилитр. Затем добавьте в каждую лунку по пять микролитров 20-кратно концентрированного флуоресцентного красителя. Перемешайте растворы с помощью пипетирования вверх и вниз.

Заклейте пластину прозрачной клеевой пленкой. Центрифугируйте планшет при 112 умноженных на G при комнатной температуре в течение двух минут. Настройте систему ПЦР в реальном времени для повышения температуры от четырех до 99 градусов Цельсия со скоростью три градуса в минуту с 10-секундным временем удержания.

Настройте систему на снятие показаний флуоресценции каждые полградуса. Установите настройку флуоресцентного фильтра. и назначьте образцы.

Проведите эксперимент и определите состояние буфера с самой высокой температурой плавления. Затем приготовьте буфер с выбранной концентрацией pH и хлорида натрия, который включает 2,5% по объему глицерина и концентрацию TCEP 0,5 миллимоляра. Охарактеризовать очищенный САД можно с помощью аналитической эксклюзионной хроматографии с многоугловым рассеянием света.

Определите наиболее стабильные соединения, пригодные для кристаллизации, и используйте подготовительную SEC, чтобы получить чистые фракции этих веществ. Проведите испытания перед кристаллизацией для определения оптимальной концентрации белка для кристаллизации. Используйте кристаллизационную роботизированную систему для дозирования желаемых коммерческих кристаллизационных растворов в резервуары раствора оптической 96-луночной наклонной пластины.

Затем используйте систему для дозирования 100 нанолитров белкового раствора в каждую лунку для кристаллизации. Перекачивать по 100 нанолитров каждого кристаллизационного раствора из пластовых скважин в соответствующие капли скважин. Заклейте пластину оптической клеевой пленкой.

Используйте микроскоп или автоматизированную систему визуализации для оценки образования и роста кристаллов каждые один-два дня в течение двух недель, а затем один раз в неделю. Когда образуются достаточно крупные кристаллы и кристаллы правильной формы, приготовьте партию кристаллизационного раствора с дополнительным 25% по объему глицерина, который будет служить криопротектором. Далее заполняем пенный дьюар жидким азотом.

Погрузите корпус для образцов unipuck в жидкий азот и дайте ему остыть. Затем вырежьте пленку над каплей, содержащей интересующий кристалл. Внесите 0,5 микролитра криопротектора на предметное стекло крышки рядом с каплей или в пустую камеру того же состояния, если таковая имеется.

Прикрепите к магнитной палочке криопетлю, установленный на стандартном основании SPINE. С помощью криопетли перенесите интересующий кристалл на каплю криопротектора. Затем с помощью криопетли переместите кристалл из криопротектора в первое пустое положение погруженного корпуса для образцов unipuck.

Повторите этот процесс, чтобы собрать дополнительные кристаллы. После того, как все интересующие кристаллы будут загружены в корпус для образцов, используйте трубку для шайбы, чтобы разместить опорную пластину unipuck на корпусе. Транспортируйте unipuck в жидком азоте к пучку.

С помощью криощипцов и инструмента для загрузки шайбы в устройство смены проб Дьюара и отсоедините корпус для проб. Затем выберите образец в программном обеспечении линии излучения для загрузки и автоматически центрируйте образец в рентгеновском луче. Получите рентгеновский флуоресцентный спектр и определите любые элементы, которые могут быть использованы в эксперименте по аномальной дифракции.

Определите оптимальную длину волны для сбора данных аномальной дифракции путем выполнения сканирования рентгеновской абсорбционной кромки. Затем получите три рентгеновские дифракционные картины с интервалом 45 градусов в стандартном режиме колебаний для автоматического определения параметров элементарной ячейки кристалла, симметрии и дифракционного предела. Импортируйте рекомендуемые параметры сбора данных в программное обеспечение линии излучения и проведите эксперимент по аномальной дифракции с одной или несколькими длинами волн.

Для определения оптимального буферного раствора была проведена оценка стабильности субстратосвязывающего белка SP0092 в различных солевых буферах. Самые высокие температуры плавления были обнаружены для буферов с pH 6,5 и концентрацией хлорида натрия в диапазоне от нуля до 0,2 моляра. Для процедуры был выбран буфер с pH 6,5 и концентрацией хлорида натрия 0,2 моляра.

Различные состояния олигомеризации SP0092 были идентифицированы и разделены с помощью SEC-MALS. Анализ профиля SEC при различных концентрациях белка показал, что повышенная концентрация белка запускает олигомеризацию, предполагая, что более крупные олигомеры более стабильны при высоких концентрациях. В соответствии с этим, большие олигомеры производили кристаллы в испытаниях кристаллизации, в то время как мономер этого не делал.

Рентгеновская флуоресценция как нативных, так и меченных селенометионином кристаллов SP0092 показала, что цинк связывается с белком в обеих формах. Аномальный сигнал был максимизирован путем настройки падающей длины волны рентгеновского излучения на края поглощения рентгеновского излучения цинка или селена. Затем был получен полный набор данных об аномалиях, а автоматический анализ, вызванный присутствием аномального сигнала, сгенерировал первоначальные карты белковых структур.

Модели, встроенные в эти первоначальные карты, затем были уточнены и проверены для создания окончательных моделей. После просмотра этого видео у вас должно сложиться четкое представление о том, как выполнить всестороннюю структурную характеристику белка, связывающего субстрат, или любой потенциальной белковой мишени. Применение этого метода распространяется на разработку новых терапевтических средств для лечения мирококковой инфекции, поскольку он обеспечивает фундаментальное понимание структурного дизайна ингибиторов для этого класса белков.

Эти методы также могут быть применены к белкам, связывающим субстрат из других организмов, и потенциально они могут быть использованы для любого типа белка.