Оценка воздействия эндокринной системы, нарушения соединения на развитие функции позвоночных нейронной сети, используя массивы многолетних электрода

Общая цель этого экспериментального протокола состоит в том, чтобы проверить влияние соединений, разрушающих эндокринную систему, таких как бисфенолы, на спайковую активность нейронных сетей позвоночных, установленных на многоэлектродных решетках. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы нейробиологии развития и экологической токсикологии, такие как механизм действия токсинов окружающей среды на развитие сетевой активности в эмбриональном мозге. Основное преимущество этого метода заключается в том, что теперь можно изучать влияние на параметры нейронной сети, такие как средняя скорость срабатывания, общее количество спайков и амплитуда спайков, а также синхронность.

Наше предыдущее исследование показало, что EDC влияют на слова и поведение, которые являются прямым выходом нейронных сетей, и наш протокол теперь направлен на понимание влияния EDC на эти сети. В день нанесения нейронов достаньте флакон с внеклеточным матриксом из морозильной камеры с отрицательными температурами 20 градусов Цельсия, опрыскайте 70% этанолом и положите на лед. Обязательно разморозьте внеклеточный матрикс на льду.

Не размораживайте при комнатной температуре, так как ЭХМ полимеризуется при температуре выше нуля градусов Цельсия. Работайте в колпаке BSL2 для разбавления внеклеточного матрикса до 25%, добавив 300 микролитров холодной нейробазальной среды к 100 микролитрам аликвоты. Затем с помощью пипетки P200 добавьте 100 микролитров 25% раствора внеклеточного матрикса в центр многоэлектродной матрицы, стараясь не касаться электродов.

Немедленно снимите ЭБУ, оставив на поверхности тонкую пленку. Накройте многоэлектродную матрицу и поместите в инкубатор для тканевых культур до тех пор, пока нейроны не будут готовы к нанесению пластин. Начните выделение нейронов цыпленка с стерилизации внешней оболочки яйца E7 с помощью 70% этанола.

С этого момента важно поддерживать стерильные условия. Убедитесь, что все инструменты стерилизованы 70% этанолом, а растворы стерильны. Полезно использовать капюшон, но он не является абсолютно необходимым для вскрытия, если оно выполняется быстро.

Затем, после извлечения и обезглавливания эмбриона, разрежьте вокруг глаз и удалите глазные яблоки. Затем с помощью тонких щипцов Dumont номер пять и пружинных ножниц сделайте разрез на вентральной стороне и удалите внешние слои кожи, чтобы обнажить передний мозг и тектум зрительного нерва. Осторожно очистите и снимите пленку от кожуры.

Перенесите передний мозг в другую чашку Петри, содержащую HBSS, и разрежьте ее на небольшие кусочки размером около двух миллиметров с помощью пружинных ножниц. С помощью стерильной трансферной пипетки перенесите кусочки переднего мозга в центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров. После того, как кусочки переднего мозга опустятся на дно пробирки центрифуги, удалите как можно больше HBSS.

Далее добавьте один миллилитр предварительно подогретого, 0,5%-ного трипсина ЭДТА и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут. С помощью пастеровской пипетки осторожно удалите трипсин, не потревожив кусочки ткани. Добавьте один миллилитр нейробазальной среды и дайте кусочкам ткани опуститься на дно.

После удаления среды и повторения промывки добавьте два миллилитра нейробазальной среды и осторожно растирайте до тех пор, пока не исчезнут кусочки ткани. Разбавьте ресуспензированные клетки один к 10 нейробазальной средой. Подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью трипанового синего красителя и гемоцитометра.

После подсчета диссоциированные ячейки помещаются на многоэлектродные матрицы с покрытием ECM с плотностью 2 200 ячеек на квадратный миллиметр. На следующий день добавьте 10 микромолярных БФА в нейробазальной среде к обработанным многоэлектродным массивам. В день приобретения замените питательную среду свежей нейробазальной средой и верните матрицы в CO2-инкубатор минимум за два часа до записи.

Запустите программное обеспечение для записи и установите температуру многоэлектродной матрицы на 37 градусов Цельсия, нажав на значок температуры. Задайте параметры захвата, выбрав потоки на левой панели окна и кликнув правой кнопкой мыши по значку музы. Затем выберите «Добавить обработку и детектор спайков» и нажмите «ОК» во всплывающем окне.

Детектор спайков шесть по STD появится под именем файла. Далее кликаем правой кнопкой мыши по детектору спайков, выбираем «Добавить обработку и детектор всплесков» и нажимаем «ОК» во всплывающем окне. Детектор всплеска ISI появится под иконкой музы.

Затем щелкните правой кнопкой мыши по детектору пакетов, выберите «Добавить обработку и компилятор нейронной статистики». Во всплывающем окне убедитесь, что выбраны заголовок файла, агрегированная статистика скважины и синхронность, нажмите OK. Компилятор статистики появится ниже. Нажмите на значок часов в нижней части экрана и измените информацию в разделе настроек на запись каждые 5,1 минуты и запись на пять минут.

Это будет запущено немедленно и выполнено один раз. После извлечения многоэлектродной матрицы из инкубатора поместите ее на записывающее устройство и зафиксируйте на месте. Начните запись сетевой активности, нажав на кнопку «Начать запись» в разделе запланированной записи.

Как правило, достаточно времени записи в пять минут, хотя можно получить более длительные записи до 10 минут. После записи верните многоэлектродную решетку в инкубатор. Среднее количество шипов значительно ниже в культурах переднего мозга цыплят, получавших BPA E7, по сравнению с контрольными культурами.

Средний индекс синхронности значительно ниже в культурах переднего мозга цыплят, получавших BPA E7, по сравнению с контрольными культурами. После освоения этой техники ее можно выполнить менее чем за три часа, если все сделать правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о необходимости поддерживать стерильные условия все время, даже во время регистрации активности спайка.

После этой процедуры влияние потенциальных препаратов, таких как противоэпилептики и антидепрессанты, на активность сети может быть оценено как шаг к пониманию механизма их действия. Многие EDC оказывают тонкое воздействие на мозг во время развития, которое проявляется в виде изменений в поведении. Поведение является прямым результатом базовой сетевой активности.

Наш протокол направлен на анализ влияния этих соединений на сетевую активность.