Целеуказание тиолы цистеина в Vitro участкам гликозилирования рекомбинантных белков

Общая цель этой процедуры заключается во включении остатков цистеина в белки путем сайт-направленного мутагенеза в нативно гликозилированных сайтах и использовании подходов к прикреплению и оценке глюкозы in vitro для оценки эффективности и структурных эффектов гликозилирования. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области структурной биологии, такие как: каковы структурные последствия гликозилирования белка и как эти модификации влияют на основные механизмы функции? Основные преимущества этой методики заключаются в том, что она легко адаптируется к изучению или обработке гликозилирования.

Он обладает высокой эффективностью, и его можно быстро оценить как структурные возмущения, так и эффективность. Применение этого метода распространяется и на терапию заболеваний, поскольку измененные паттерны гликозилирования были связаны с несколькими видами рака и нейродегенеративными расстройствами. Хотя этот метод может дать представление о влиянии нативно гликозилированных белков, он также может предоставить столь необходимую информацию о том, как изменить паттерны гликозилирования, которые могут способствовать развитию этого ряда заболеваний.

Чтобы ввести одну мутацию цистеина в вектор экспрессии, подготовьте две отдельные ПЦР-реакционные пробирки. В первую пробирку добавьте прямой мутагенный праймер, а во вторую пробирку добавьте обратный мутагенный праймер. Добавьте в обе пробирки концентрацию 1X PCR буфера.

Затем настройте программу из пяти циклов для двух отдельных реакционных пробирок ПЦР. Добавьте время продления в семь с половиной минут при температуре 72 градуса Цельсия в конце пятого цикла. После завершения пяти циклов смешайте две отдельные ПЦР-реакции в одной пробирке, центрифугируйте пробирку в течение примерно трех секунд и повторите еще 20 циклов в тех же условиях ПЦР.

Затем запустите 15 микролитров образца на 1%-ный агарозный гель ДНК при напряжении 120 В в течение 40 минут. Затем погрузите гель в воду, содержащую 0,5 миллиграмм на миллилитр бромида этидия и встряхните его при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем подтвердите усиление шаблона под воздействием ультрафиолетового излучения на длине волны 302 нанометра.

После этого к оставшимся 25 микролитрам реакционной смеси ПЦР добавить 0,5 микролитра фермента рестрикции DPN1. Инкубируйте смесь в течение двух с половиной часов при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы переварить метилированную матрицу ДНК. Затем добавьте примерно от пяти до 10 микролитров переваренной смеси к 100 микролитрам компетентных клеток E.coli и инкубируйте на льду в течение 60 минут.

смесь клеток и ДНК тепловым ударом при температуре 42 градуса Цельсия в течение 45 секунд на сухом тепловом блоке. Затем сразу же выдержите смесь на льду в течение трех минут. Далее добавьте в клетки 900 микролитров бульона LB и переложите суспензию в стерильную пробирку с круглым дном объемом 14 миллилитров.

Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия с постоянным встряхиванием при 190 об/мин в течение 90 минут. Затем распределите центрифугированную клеточную гранулу на агаровых планшетах с антибиотиками. Инкубируйте пластины при температуре 37 градусов Цельсия в течение 16 часов.

На следующий день асептически инокулируйте одну колонию из планшета в пять миллилитров среды, обогащенной антибиотиками. Затем выращивайте культуру в течение ночи при температуре 37 градусов по Цельсию с постоянным встряхиванием. Трансформируйте мутировавшую плазмиду остатка цистеина в клетки E.coli с помощью лечения тепловым шоком с последующим выращиванием культуры в течение ночи в среде LB с добавлением антибиотиков.

На следующий день непосредственно рассыпьте 150 микролитров клеточной суспензии на планшетах с добавленным канамицином агаром LB и держите пластины для ночной инкубации при температуре 37 градусов Цельсия. На следующий день асептически перенесите одну колонию в 20 миллилитров среды LB в колбу Эрленмейера и оставьте на ночь для инкубации при температуре 37 градусов Цельсия. На следующий день переложите культуру на ночь в коническую пробирку объемом 50 миллилитров

Затем гранулируйте клетки, центрифугируя жидкую культуру в течение ночи при температуре 2,400 G в течение 15 минут. Далее добавьте в клеточную гранулу 10 миллилитров минимальной среды М9 и затем суспензируйте клеточную смесь в одном литре среды М9, содержащей канамицин. Продолжайте выращивать жидкую культуру M9 при температуре 37 градусов Цельсия с постоянным встряхиванием при скорости около 190 об/мин, пока оптическая плотность на глубине 600 нанометров не достигнет примерно 0,6–0,8.

Затем добавьте 200 микромолей IPTG к культуре M9 для индуцирования экспрессии белка и оставьте культуру расти на ночь. На следующий день гранулируйте бактериальные клетки из ночной культуры путем центрифугирования при температуре примерно в 10 000 раз G при четырех градусах Цельсия в течение 30 минут. С помощью моторизованной переводной пипетки объемом 10 миллилитров гомогенизируйте замороженную бактериальную клеточную гранулу примерно в 40 миллилитров гомогенизационного буфера.

Затем инкубируйте гомогенат в гибридизационной печи в течение 90 минут при постоянном вращении. Центрифугируйте смесь при температуре приблизительно 15 000 раз G при восьми градусах Цельсия в течение 40 минут, чтобы отделить растворимую белковую фракцию от нерастворимой гранулы. Затем добавьте 50% объемного объема никелево-нитрилотриуксусной кислоты суспензию из агарозных гранул в надосадочную жидкость и инкубируйте путем инверсии в гибридизационной печи в течение 90 минут при комнатной температуре.

Затем используйте колонку для очистки белка гравитационным потоком для сбора агарозных шариков с белком, меченным гексахистидином, прикрепленным к никелю. Наконец, вымойте собранные агарозные бусины три раза. Разбавьте белки в ряд из двух миллилитровых фракций.

Затем подтвердите наличие очищенного белка, меченного гексахистидином, в элюированных фракциях, с помощью геля, окрашенного в синий цвет SDS-PAGE. Объедините элюированные белковые фракции в диализную мембрану с отсечкой молекулярной массы 3 500 дальтон и инкубируйте в буфере при четырех градусах Цельсия в течение ночи с помощью магнитного перемешивания. Затем добавьте примерно одну единицу тромбина на миллиграмм белка к объединенному белку в диализной мембране и снова инкубируйте в течение одного дня при четырех градусах Цельсия.

На следующий день извлеките белок из диализного мешка и сконцентрируйте его примерно в десять раз с помощью ультрафильтрационного центробежного концентратора с отсечкой молекулярной массы 10 000 дальтон. Затем повторно разбавьте белковый концентрат примерно в 20 раз в буфере для повторного сворачивания без хлорида натрия. Чтобы очистить белок, загрузите его в предварительно упакованную анионообменную колонку, уравновешенную тем же буфером, не содержащим хлорида натрия.

Начните элюирование белков с градиентом от нуля до 60% одного молярного хлорида натрия, содержащего рефолдирующий буфер. Переложите объединенные белковые фракции в мешок для диализа. Проведите этап диализа при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи, чтобы обменять белок на экспериментальный буфер с оптимальной молярной концентрацией хлорида натрия.

Во-первых, диализуйте 1,5 миллилитра примерно 60 микромолярного белка в один литр буфера для модификации для гликозилирования белка. Через 24 часа, при четырех градусах Цельсия, перенесите модифицированный белок в микроцентрифужную пробирку и добавьте растворенную в ДМСО глюкозу-5-MTS до конечной концентрации в два миллимоля. Осторожно постукивайте по микроцентрифужной пробирке каждые 10 минут, инкубируя образец в темноте в течение часа при температуре окружающей среды.

После инкубации проведите диализ при четырех градусах Цельсия, чтобы повторно заменить белок в окончательный экспериментальный буфер. Измерьте точную массу белка с помощью масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением. Наконец, используйте раствор ЯМР для расчета эффективности модификации и идентификации структурных изменений гликозилированных остатков cys в белке.

Успешная мутационная ПЦР-амплифицированная матричная ДНК показана в этом репрезентативном агарозном геле с 1%-ной ДНК. В качестве контроля в геле используется лестница ДНК и эквивалентное количество матричной ДНК, которая не была амплифицирована методом ПЦР. Самая верхняя полоса с высокоинтенсивным окрашиванием бромидом этидия показывает усиленный шаблон нужного размера.

Далее белок очищали с помощью анионообменной колонки. Хроматограмма показывает профиль элюирования, наблюдаемый на глубине 280 нанометров синим цветом, с тремя пиками, элюирующими на фоне градиента хлорида натрия, обозначенного красным цветом, с возрастающей концентрацией до 0,6 моляра. На нижней панели показан окрашенный в синий цвет гель SDS-PAGE из белковых фракций.

Гликозилирование остатков цистеина определяли методом масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением. Хроматограмма показывает массы немодифицированного и модифицированного белка до и после гликозилирования остатка цистеина. Для подтверждения был проведен ЯМР раствора, показывающий спектральное наложение HSQC специфических химических сдвигов амида, специфичных для остатков, что указывает как на модификации, так и на структурные возмущения гликозилированного белка.

Когда он будет освоен, все этапы от мутагенеза до оценки ЯМР могут быть завершены примерно за 12 дней, не считая времени ожидания синтеза праймеров, секвенирования ДНК и услуг масс-спектроскопии. При попытке проведения этой процедуры важно помнить о необходимости оценки структурных и биофизических эффектов мутаций цистеина в отсутствие модификации тиола в качестве контрольных измерений базовой линии. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как стабильность, вторичная структура, связывание ионов, оценка белок-белкового взаимодействия, чтобы выявить, как гликозилирование влияет на биофизические свойства основных белковых функций.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области кальциевой сигнализации к индивидуальной и кумулятивной оценке роли аспарагина 131 и аспарагина 171 и гликозилирования в стромальном взаимодействии молекулы кальция One Calcium Signaling, связанной с накопленным поступлением кальция.