Развитие человека доклинических модели Osteoclastogenesis от периферической крови моноциты совместно культивируемых с линии клеток рака молочной железы
13 сентября 2017 г.
Этот протокол описывает развитие в vitro человека доклинических модели osteoclastogenesis от периферической крови моноциты, культивируемых с линии клеток рака молочной железы для имитации взаимодействия клеток остеокластов рака. Модель может использоваться для нашего понимания формирования метастазы костей и улучшать терапевтические возможности.
Общая цель этой доклинической модели остеокластогенеза in vitro человека, полученной из моноцитов периферической крови, или PBMC, культивируемых с клеточными линиями рака молочной железы, заключается в имитации взаимодействия остеокластов раковых клеток. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области метастазирования в кости о влиянии взаимодействия раковых клеток и костных клеток в микроокружении кости. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она представляет собой полностью человеческую доклиническую модель.
Кроме того, этот метод может дать представление о метастазировании в кости. Он также может быть применен для изучения других патологических механизмов, связанных с костями, таких как остеопороз. Люди, плохо знакомые с этим методом, могут испытывать трудности из-за вариабельности среди здоровых доноров и при выборе подходящей плотности клеток PBMC.
Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как им необходимо ознакомиться с нашим выбором PBMC, а этапы посева требуют некоторого ручного опыта, прежде чем можно будет достичь мастерства. Начните с разбавления не менее 20 миллилитров цельной крови здорового донора в ЭДТА в соотношении один к одному в PBS. Тщательно перемешав, разделите кровяной раствор на 30 миллилитров аликвот в 50 миллилитровых конических пробирках.
Аккуратно заложите 15 миллилитров среды для разделения лимфоцитов на дно каждой пробирки. Разделите ячейки с помощью центрифугирования с градиентом плотности. И вытащите белую мононуклеарную ячейку, содержащую охристые оболочки, в новую 15-миллилитровую трубку.
Промойте собранные клетки два раза в 20 миллилитрах PBS на одну промывку, а затем лизисируйте эритроциты пятью миллилитрами буфера для лизиса эритроцитов в течение трех-пяти минут на льду. Остановите реакцию с помощью 20 миллилитров PBS и соберите лейкоциты центрифугированием. Повторно суспендируйте гранулу и укомплектуйте альфа М-Е-М для подсчета.
Затем поместите клетки в соотношении семь целых пять десятых по 10 до пяти PBMC на квадратный сантиметр в каждой лунке 24-луночного планшета для их инкубации при 37 градусах Цельсия и пяти процентах CO2. Примерно через три часа удалите надосадочную жидкость, мусор, неприкрепленные клетки и нелизированные эритроциты из культур. И добавить свежую среду, дополненную МКБ.
Через четырнадцать дней после посева два раза промойте клетки PBS, и зафиксируйте их в четырехпроцентном параформальдегиде на 20 минут при комнатной температуре. Выполняйте окрашивание ловушек в соответствии с инструкциями производителя. Остеокластоподобные клетки будут TRAP-положительными, по крайней мере, с четырьмя ядрами.
Подсчитайте остеокластоподобные клетки вручную под микроскопом при 10-кратном увеличении. Для индуцированной опухолевыми клетками дифференцировки остеокластов, когда раковые клетки достигают девяноста процентов конфлюенции, они отделяются трипсинизацией и засеваются на нулевые целые четыре десятых микрометровые вставки в соотношении четыре десятых 10 к 3 клеткам на квадратный сантиметр в свежем альфа-МЭМ. На следующий день поместите засеянные вставки поверх недифференцированных однодневных мононуклеарных клеточных культур в полном альфа-M-E-M и меняйте среду каждые два-три дня.
Затем, через 11 дней после начала совместного культивирования, перенесите вставки в новую пластину, содержащую соответствующий реагент для желаемого последующего анализа. Клетки рака молочной железы могут поддерживать остеокластогенез, так как количество остеокластов в лунках, индуцированных раковыми клетками, аналогично тому, которое получается в лунках с положительным фактором роста. Однако количество остеокластов, наблюдаемое во всех культурах, уменьшается при обработке клеток противоопухолевым препаратом.
Интересно, что площадь поверхности зрелых остеокластов, полученных из факторов роста, больше, чем у тех, которые индуцируются раковыми клетками. Этот эффект не наблюдается в противоопухолевых культурах, обработанных препаратами. После освоения эта техника может быть завершена за семь восемь часов, если она выполнена правильно.
После этой процедуры может быть проведен дополнительный последующий анализ, такой как анализ экспрессии генов, вестерн-блоттинг, иммунофлуоресцентный анализ или ИФА, чтобы ответить на дополнительные вопросы о взаимодействиях раковых клеток/костных клеток или о механизмах противоопухолевых препаратов. После своего развития эта методика открывает путь исследователям в области метастазирования костей к изучению микроокружения кости в полностью доклинической модели человека. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как проводить совместное культивирование моноцитов, проходить дифференцировку с раковыми клетками.
Не забывайте, что работа с биологическими образцами и лекарствами может быть чрезвычайно опасной, и что при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение перчаток и лабораторных халатов.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Этот протокол описывает разработку in vitro доклинической модели остеокластогенеза из периферических кровяных моноцитов, культивированных с линиями клеток рака молочной железы, для моделирования взаимодействия раковых клеток и остеокластов. Эта модель может помочь ответить на ключевые вопросы, касающиеся костных метастазов, и улучшить терапевтические возможности.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Остеокластогенез
- Костные метастазы
- Взаимодействия раковых клеток
Предыстория
- Модель использует периферические кровяные моноциты (ПКМ).
- Она нацелена на репликацию взаимодействий между раковыми клетками и остеокластами.
- Это исследование важно для понимания костных патологий.
- Вариабельность среди здоровых доноров может влиять на результаты.
Цель исследования
- Моделирование взаимодействий раковых клеток и остеокластов.
- Исследование эффектов этих взаимодействий в костной среде.
- Получение взгляда на костные метастазы и связанные состояния.
Используемые методы
- Культивирование ПКМ с линиями клеток рака молочной железы.
- Оценка остеокластогенеза.
- Оценка взаимодействий раковых клеток и костных клеток.
- Анализ вариабельности плотности клеток ПКМ.
Основные результаты
- Модель успешно моделирует взаимодействия раковых клеток и остеокластов.
- Полученные результаты могут информировать терапевтические стратегии для костных метастазов.
- Потенциальные применения распространяются на другие заболевания костей.
- К проблемам относятся вариабельность доноров и выбор соответствующей плотности клеток ПКМ.
Выводы
- Эта доклиническая модель человека ценна для изучения костных метастазов.
- Она улучшает понимание взаимодействий раковых клеток в костной среде.
- Будущие исследования могут использовать эту модель для более широких применений в костной патологии.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
This fully human preclinical model enables mechanistic de-risking of osteoclastogenic pathways in bone metastasis by recapitulating cancer cell-osteoclast crosstalk in a physiologically relevant system. It supports target validation and assay development for anti-tumor therapeutics by providing quantitative readouts of osteoclast differentiation and function. The model enhances predictive confidence in lead identification by allowing direct observation of reciprocal interactions and downstream analysis of both cell types under drug treatment conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding tumor-induced osteoclastogenesis and pathway clarification in the bone microenvironment.
- Operational Value: Supports biological de-risking and functional target validation by modeling osteoclast differentiation from primary human monocytes under defined co-culture conditions.
- Scientific Value: Facilitates predictive confidence and portfolio triage by quantifying osteoclast formation in response to cancer cell stimuli versus growth factor controls.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows through standardized osteoclast differentiation from PBMCs using RANKL and MCSF.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility via fixed cell density seeding (7.5×10⁵ PBMC/cm²) and timed differentiation (14 days) with TRAP-based osteoclast quantification.
- Scientific Value: Enables reliable compound evaluation by testing drug effects on osteoclastogenesis in both indirect (conditioned medium) and direct co-culture formats.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease relevance modeling for osteoporosis and other bone conditions through adaptation of the osteoclastogenesis assay.
- Operational Value: Ensures translational continuity by using fully human cells, reducing species translation risk in preclinical-to-clinical extrapolation.
- Scientific Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by measuring changes in osteoclast number and surface area as pharmacodynamic biomarkers of drug efficacy.
Pipeline & Workflow Integration
The model fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, particularly for bone-targeted therapies and bone microenvironment modulators.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of cancer cell-derived factors in osteoclast activation and pathway clarification of RANKL-independent osteoclast induction mechanisms.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized monocyte isolation, differentiation, and co-culture with breast cancer cell lines on permeable inserts for paracrine and juxtacrine signaling studies.
- Analytics: Provides quantitative osteoclast readouts via TRAP staining, multinucleated cell counting, and morphometric analysis (surface area) to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling study of drug effects on the metastatic bone microenvironment using clinically relevant breast cancer cell lines.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for studying osteoclast modulation across multiple cancer types and bone pathologies beyond breast cancer.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Delivers predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in osteoclast-cancer cell interactions.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined PBMC isolation, seeding density, and cytokine supplementation protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of drug effects on osteoclast formation and function, reducing late-stage biological risk in bone metastasis programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by quantifying osteoclastogenic potential of compounds and guiding advancement based on bone microenvironment modulation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary human cell isolation, culture, and differentiation techniques, including PBMC separation and monocyte adherence.
- Depends on instrumentation for cell counting, centrifugation, microscopy (10X magnification for osteoclast counting), and incubation (37°C, 5% CO₂).
- Necessitates cross-team standardization of PBMC donor sourcing, cell density optimization (7.5×10⁵ PBMC/cm²), and co-culture timing (11 days post-cancer cell seeding) to minimize variability.
- Involves adaptation considerations when extending to non-breast cancer cell lines or alternative osteoclast stimuli beyond RANKL/MCSF.
- Includes practical limitations such as donor variability in osteoclast differentiation potential and the need for manual proficiency in PBMC seeding and co-culture setup.
