Развитие человека доклинических модели Osteoclastogenesis от периферической крови моноциты совместно культивируемых с линии клеток рака молочной железы

Общая цель этой доклинической модели остеокластогенеза in vitro человека, полученной из моноцитов периферической крови, или PBMC, культивируемых с клеточными линиями рака молочной железы, заключается в имитации взаимодействия остеокластов раковых клеток. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области метастазирования в кости о влиянии взаимодействия раковых клеток и костных клеток в микроокружении кости. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она представляет собой полностью человеческую доклиническую модель.

Кроме того, этот метод может дать представление о метастазировании в кости. Он также может быть применен для изучения других патологических механизмов, связанных с костями, таких как остеопороз. Люди, плохо знакомые с этим методом, могут испытывать трудности из-за вариабельности среди здоровых доноров и при выборе подходящей плотности клеток PBMC.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как им необходимо ознакомиться с нашим выбором PBMC, а этапы посева требуют некоторого ручного опыта, прежде чем можно будет достичь мастерства. Начните с разбавления не менее 20 миллилитров цельной крови здорового донора в ЭДТА в соотношении один к одному в PBS. Тщательно перемешав, разделите кровяной раствор на 30 миллилитров аликвот в 50 миллилитровых конических пробирках.

Аккуратно заложите 15 миллилитров среды для разделения лимфоцитов на дно каждой пробирки. Разделите ячейки с помощью центрифугирования с градиентом плотности. И вытащите белую мононуклеарную ячейку, содержащую охристые оболочки, в новую 15-миллилитровую трубку.

Промойте собранные клетки два раза в 20 миллилитрах PBS на одну промывку, а затем лизисируйте эритроциты пятью миллилитрами буфера для лизиса эритроцитов в течение трех-пяти минут на льду. Остановите реакцию с помощью 20 миллилитров PBS и соберите лейкоциты центрифугированием. Повторно суспендируйте гранулу и укомплектуйте альфа М-Е-М для подсчета.

Затем поместите клетки в соотношении семь целых пять десятых по 10 до пяти PBMC на квадратный сантиметр в каждой лунке 24-луночного планшета для их инкубации при 37 градусах Цельсия и пяти процентах CO2. Примерно через три часа удалите надосадочную жидкость, мусор, неприкрепленные клетки и нелизированные эритроциты из культур. И добавить свежую среду, дополненную МКБ.

Через четырнадцать дней после посева два раза промойте клетки PBS, и зафиксируйте их в четырехпроцентном параформальдегиде на 20 минут при комнатной температуре. Выполняйте окрашивание ловушек в соответствии с инструкциями производителя. Остеокластоподобные клетки будут TRAP-положительными, по крайней мере, с четырьмя ядрами.

Подсчитайте остеокластоподобные клетки вручную под микроскопом при 10-кратном увеличении. Для индуцированной опухолевыми клетками дифференцировки остеокластов, когда раковые клетки достигают девяноста процентов конфлюенции, они отделяются трипсинизацией и засеваются на нулевые целые четыре десятых микрометровые вставки в соотношении четыре десятых 10 к 3 клеткам на квадратный сантиметр в свежем альфа-МЭМ. На следующий день поместите засеянные вставки поверх недифференцированных однодневных мононуклеарных клеточных культур в полном альфа-M-E-M и меняйте среду каждые два-три дня.

Затем, через 11 дней после начала совместного культивирования, перенесите вставки в новую пластину, содержащую соответствующий реагент для желаемого последующего анализа. Клетки рака молочной железы могут поддерживать остеокластогенез, так как количество остеокластов в лунках, индуцированных раковыми клетками, аналогично тому, которое получается в лунках с положительным фактором роста. Однако количество остеокластов, наблюдаемое во всех культурах, уменьшается при обработке клеток противоопухолевым препаратом.

Интересно, что площадь поверхности зрелых остеокластов, полученных из факторов роста, больше, чем у тех, которые индуцируются раковыми клетками. Этот эффект не наблюдается в противоопухолевых культурах, обработанных препаратами. После освоения эта техника может быть завершена за семь восемь часов, если она выполнена правильно.

После этой процедуры может быть проведен дополнительный последующий анализ, такой как анализ экспрессии генов, вестерн-блоттинг, иммунофлуоресцентный анализ или ИФА, чтобы ответить на дополнительные вопросы о взаимодействиях раковых клеток/костных клеток или о механизмах противоопухолевых препаратов. После своего развития эта методика открывает путь исследователям в области метастазирования костей к изучению микроокружения кости в полностью доклинической модели человека. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как проводить совместное культивирование моноцитов, проходить дифференцировку с раковыми клетками.

Не забывайте, что работа с биологическими образцами и лекарствами может быть чрезвычайно опасной, и что при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение перчаток и лабораторных халатов.