Поколение ген нарушена Streptococcus mutans штамм без генов клонирования

Общая цель этой процедуры заключается в создании целевых штаммов Streptococcus mutans, разрушенных генами, с помощью двухступенчатой ПЦР и электропорации. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области микробиологии, например, как работает интересующий нас ген. Главное преимущество данной методики заключается в том, что не требуется никакой ферментативной реакции, кроме ПЦР, и грамотная подготовка клеток к электропорации достаточно проста. Хотя этот метод может дать представление о технике разрушения гена Streptococcus mutans, он также может быть применен к другим видам микроорганизмов, таким как золотистый стафилококк. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что они не знакомы с эффективностью вложенных праймеров для второй ПЦР. Демонстрировать процедуру будет доктор Аяко Окада, научный руководитель нашей лаборатории. Чтобы начать эту процедуру, нанесите бульон S.mutans UA159 на мозговую инфузию сердца или агаровую пластину BHI и инкубируйте пластину в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия в анаэробных условиях. На следующий день используйте стерилизованную зубочистку, чтобы сорвать одну колонию и ввести ее в пять миллилитров бульона BHI. Инкубируйте культуру S.mutans в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия в анаэробных условиях. Далее центрифугируйте культуру при 2000 умноженных на G в течение 15 минут. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в пяти миллилитрах PBS. Снова центрифугируйте при 2000 умноженных на G в течение 15 минут. Ресуспендируйте полученную клеточную гранулу в 200 микролитрах PBS. Извлеките геномную ДНК из суспензии с помощью набора для экстракции геномной ДНК на основе бисера. Сначала перенесите клеточную суспензию в двухмиллилитровую пробирку для образца, содержащую стеклянные шарики. Затем добавьте в клеточную суспензию 750 микролитров лизисного раствора. Плотно закройте пробирки крышками и поместите их симметрично в держатель трубки устройства для отбивания бусин. Обрабатывайте на максимальной скорости в течение пяти минут. Центрифугируйте взбитые в бусинах образцы при 10 000-кратном G в течение одной минуты. Перенесите надосадочную жидкость в спиновую колонку в двухмиллилитровую сборную пробирку и центрифугируйте при 7000-кратном перегрузке в течение одной минуты. Добавьте в фильтрат 1200 микролитров ДНК-связывающего буфера и перенесите 800 микролитров смеси в спиновую колонку в двухмиллилитровой пробирке для сбора. Центрифугируйте при 10 000 умноженных на G в течение одной минуты. Откажитесь от проточного потока. Добавьте 200 микролитров буфера предварительной промывки в спиновую колонну для промывки матрицы колонки и центрифуги в 10 000 раз G в течение одной минуты. Откажитесь от проточной части, добавьте 500 микролитров промывочного буфера в спиновую колонну для промывки матрицы колонки и снова центрифугируйте. Поместите каждую спиновую колонку в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра и добавьте 100 микролитров элюирующего буфера в матрицу колонки. Центрифугируйте при 10 000 G в течение 30 секунд, чтобы элюировать геномную ДНК. Оцените концентрацию и чистоту ДНК, измерив поглощение на глубинах 260 нанометров и 280 нанометров с помощью спектрофотометра. Первая ПЦР проводится с использованием генома дикого типа S.mutans и гена устойчивости к синтетическому стрептомицину в качестве ПЦР-матриц. Для амплификации соответственно используются три набора праймеров: восходящая фланкирующая область гена гликозилтрансферазы С или gtfC, нисходящая фланкирующая область гена gtfC и ген резистентности к спектиномицину. Фракционируйте каждый продукт ПЦР по 1%-ному агарозному гелю. Размер каждого изделия из первого ПЦР должен составлять примерно один КБ. Используйте резак для гелевой ленты, чтобы вырезать соответствующие полосы и очистить каждый продукт амплифицированной ДНК, как указано в текстовом протоколе. Следующим шагом является использование трех примерно равных молярных фрагментов в качестве ПЦР-матриц для проведения второй ПЦР. Эти фрагменты амплифицируются и сращиваются с использованием соответствующих праймеров для создания разрушающей конструкции. Поскольку успех этой процедуры зависит от амплификации разрушающей конструкции методом второй ПЦР, важно подтвердить второй продукт ПЦР методом электрофореза. Загрузите 1/10 реакционной смеси ПЦР в 0,8%-ный агарозный гель, чтобы подтвердить, что полученный ампликон имеет прогнозируемый размер полосы. В этом примере вложенные праймеры дали гораздо лучшее усиление. Переложите оставшуюся смесь для ПЦР в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра и добавьте 55 микролитров сверхчистой воды, чтобы довести общий объем до 100 микролитров. Добавьте 1/10 объема трех моляров ацетата натрия pH 5,2, затем 2,5 объема 100% этанола и перемешайте.Заморозьте при температуре минус 80 градусов Цельсия на 30 минут. Центрифугируйте при 15 000 умноженных на G при четырех градусах Цельсия в течение 20 минут. Когда центрифугирование будет завершено, проверьте наличие гранул на дне пробирки. Выбросьте надосадочную жидкость. Промойте гранулу одним миллилитром 70% этанола и поставьте центрифугой при температуре 15 000 раз G при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. Выбросьте надосадочную жидкость и высушите гранулу на воздухе в течение примерно 30 минут. Наконец, растворите гранулу в 10 микролитрах сверхчистой воды. Компетентные клетки S.mutans UA159 были предварительно подготовлены и сохранены в виде аликвот по 50 микролитров при температуре минус 80 градусов Цельсия.Смешайте каждые 50 микролитров аликвот ледяных компетентных клеток с пятью микролитрами разрушающей конструкции. Добавляйте смесь в кюветы для электропорации с расстоянием между электродами 0,2 сантиметра. Проводят электропорацию с помощью режима Staphylococcus aureus аппарата для электропорации. Сразу после электропорации суспензируйте клетки в 500 микролитрах бульона BHI и добавьте 50 микролитров суспензии в агаровые пластины BHI, содержащие спектиномицин. Инкубируйте планшеты в течение двух-шести дней при 37