Поколение моделей клеток рака простаты сопротивления против митотическая агент доцетаксел

Общая цель этой процедуры заключается в создании экспериментальных моделей устойчивых к доцетакселу раковых клеток в качестве платформы для изучения молекулярных механизмов, вызывающих устойчивость к антимитотической терапии. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии раковых клеток и генома, такие как выявление сигнальных путей, способствующих прогрессированию заболевания, и определение потенциальных целевых стратегий. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он является надежным и простым способом создания экспериментальных моделей для изучения реакции противораковых препаратов помимо использования образцов опухолей пациента и животных моделей.

Демонстрировать процедуру будут Лиза Мор, постдок из моей лаборатории, и Юнгрим Ву, еще один постдок из нашей команды. Для начала этой процедуры поместите ячейки DU145 или 22Rv1 в колбы площадью 150 сантиметров квадратного сечения, содержащие 20 миллилитров среды. Через 24 часа, когда конфлюенция клеток составляет от 70 до 80%, добавьте доцетаксел в концентрации пять наномоляров.

Через 72 часа аспирируйте среду, содержащую препарат, и добавьте свежую среду, не содержащую доцетаксела. Меняйте носители каждые три-четыре дня. Подождите одну-две недели, пока в колбе появятся клоны.

Отсадите среду, тщательно промойте клетки 15 миллилитрами PBS и инкубируйте их с четырьмя миллилитрами 0,05% трипсина-ЭДТА в течение трех-пяти минут при 37 градусах Цельсия, чтобы оторвать клетки от поверхности колбы. Затем повторно суспензируйте трипсинизированные клетки из колбы, используя восемь миллилитров свежей среды. Вытащите ячейки из всех обработанных колб и гранулируйте их центрифугированием.

После этого извлеките суперна-ден, повторно суспендируйте клеточную гранулу в 20 миллилитрах свежей среды и поместите клетки в колбы площадью 150 квадратных сантиметров. Через 24 часа, когда конфлюенция клеток составляет от 70 до 80%, снова добавьте пять наномолярных доцетакселов. Повторяйте процедуры, как показано ранее, до тех пор, пока клоны не появятся в колбе.

Затем снова разложите ячейки по 150 квадратным колбам. Через 24 часа, когда клетки находятся примерно на 70-80% конфлюенции, обработайте их 10 наномолярным доцетакселом. Повторяйте те же шаги по нарастающей дозе доцетаксела и продолжайте объединять выжившие клоны после каждой концентрации.

В конце процесса вы получите пул устойчивых клеток, готовых к экспериментальному использованию. В этой процедуре планшет 2000 клеток используют 2 миллилитра среды на лунку в шести луночных планшетах. Через 24 часа добавьте возрастающие концентрации доцетаксела для клеточных линий DU145 и 22Rv1.

Добавляйте ДМСО только в одну лунку в качестве контроля в том же объеме, который используется для самой высокой дозы доцетаксела. Через 72 часа аспирируйте среду, содержащую препарат, и добавьте свежую среду, не содержащую доцетаксела. Инкубируйте планшеты в течение одной-двух недель, пока колонии не станут видны под микроскопом.

Чтобы испачкать колонии, аккуратно промойте их двумя-тремя миллилитрами PBS. Инкубируйте их с двумя-тремя миллилитрами кристаллического фиолетового раствора в течение 20 минут внутри вытяжного шкафа для культуры тканей или вытяжного шкафа. После этого удалите стоячий раствор и промойте пластины двумя-тремя миллилитрами воды.

Затем удалите воду, а тарелки обсушите на воздухе. Сделайте цифровые изображения пластин для представления фигуры. Анализируйте результат, визуализируя лунки, и вручную подсчитывая колонии с помощью маркера.

И представляют процент жизнеспособности клеток на графике. Ниже приведена диаграмма, показывающая определение Docetaxel IC50 в родительских клеточных линиях рака предстательной железы DU145 и 22Rv1. Здесь показаны ожидаемые проценты жизнеспособности клеток в необходимой дозе доцетаксела при возрастающих концентрациях.

А вот репрезентативные микроскопические изображения клеток DU145 и 22Rv1 в указанные моменты времени генерации резистентности к доцетакселу. Красные стрелки указывают на клон, устойчивый к доцетакселу, после завершения протокола. Здесь представлены репрезентативные анализы колониеобразования, соответствующие функциональной валидации доцетаксел-резистентных клеток.

Клетки подвергались воздействию возрастающих концентраций доцетаксела, и выживаемость оценивалась путем окрашивания кристаллическим фиолетовым цветом. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как создавать и валидировать лекарственно-устойчивые клеточные линии, которые затем можно использовать для обследований и процедур по вашему выбору, таких как анализ экспрессии генов и генетические манипуляции. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.