Большой объем, поведенчески соответствующего освещения для Оптогенетика в Non-human приматов

Общая цель этого протокола заключается в создании осветителя тканей большого объема, который хорошо подходит для оптогенетических манипуляций у нечеловекообразных приматов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии, например, как популяции нейронов в различных областях мозга влияют на поведение и как временные паттерны возбуждения нейронов в одной области могут влиять на другую область? Основное преимущество этой техники заключается в том, что она использует свет и, таким образом, позволяет оптогенетически манипулировать большими поведенчески значимыми объемами мозга с минимальным повреждением тканей.

Применение этого метода распространяется на трансляционную медицину из-за сходства между человеческим и нечеловеческим мозгом приматов. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что требуется некоторая практика, чтобы оказывать должное давление при натяжении этих волокон. Чтобы начать эту процедуру, с помощью острых ножниц отрежьте участок пластикового оптического волокна диаметром 250 микрометров, который как минимум на 10 сантиметров длиннее желаемой общей длины осветителя.

Затем снимите от 15 до 20 сантиметров полиэтиленовой оболочки с одного конца пластикового оптического волокна с помощью устройства для зачистки проводов 22-го калибра. Затем закрепите крайние дистальные три-пять сантиметров зачищенного конца волокна в настольных тисках зажимом. Натянуто держите оболочечный конец волокна в одной руке, с постоянным устойчивым натяжением.

Волокно должно быть параллельно полу, оттянуто от тисков. Поддерживайте это постоянное натяжение волокна на протяжении всего нагрева и охлаждения, чтобы волокно оставалось прямым и натянутым по мере истончения. Используя самую низкую настройку двухтемпературного термофена, нагрейте зачищенный участок волокна до тех пор, пока он не истончится до диаметра от 60 до 100 микрометров, или примерно до диаметра человеческого волоса.

Поддерживайте постоянное натяжение волокна, позволяя ему остыть. Неспособность поддерживать натяжение или перегрев волокна может привести к его скручиванию и/или разрыву. Чтобы поддерживать постоянное натяжение волокна при его нагревании, используйте недоминирующую руку, чтобы вам не пришлось отпускать ее при использовании термофена.

Кроме того, вы можете аккуратно обернуть волокно вокруг ладони, чтобы получить еще лучший захват. Как только волокно полностью остынет и будет достигнут нужный диаметр, зажмите волокно на три сантиметра от самого узкого места с обеих сторон. Быстрым резким натяжением вдоль оси волокна разделите стороны, чтобы получился конусообразный кончик.

Затем рассмотрите конический наконечник в условиях малой мощности под диссекционным микроскопом. Если кончик раздвоенный или скрученный, выбросьте волокно. Даже при большой практике около трети волокон будут иметь раздвоенные или закрученные кончики.

Мы просто выбрасываем эти волокна, а не пытаемся их восстановить, так как так быстро и недорого вытащить еще одно. Подготовьтесь к травлению конического наконечника, поместив кусок лабораторного скотча рядом с концом наконечника, оставив нужную длину наконечника открытой. Здесь обнажаются последние пять миллиметров.

Лента защищает волокно от травления выше желаемой длины светового излучения. После этого сложите небольшой квадрат из пятимикрометрового листа из карбида кремния между большим и указательным пальцами. Поместите кончик волокна между двумя сторонами притирочного листа и аккуратно протравите волокно небольшими круговыми движениями.

Часто поворачивайте волокно так, чтобы все стороны были равномерно протравлены. Далее снимите около пяти миллиметров полиэтиленовой оболочки с противоположного конца осветителя с помощью средства для зачистки проводов 22-го калибра. Затем разрежьте противоположный конец горячим ножом, чтобы разгладить поверхность.

Прикрепите разъем на конце осветителя напротив вытравленного наконечника. Это позволяет подключать осветитель к оптическому кабелю или лазеру. После этого отполируйте противоположный конец все более тонкими притирочными листами.

Затем вставьте плоский противоположный конец в наконечник из нержавеющей стали внутреннего диаметра 260 микрометров до тех пор, пока он не окажется на одном уровне с концом наконечника. Визуально убедитесь, что противоположный конец гладко и равномерно отполирован волоконным микроскопом. Закрепите наконечник вертикально на краю стола так, чтобы меньшее отверстие наконечника было направлено вниз.

Затем наполните одномиллилитровый шприц пластиковой эпоксидной смолой и прикрепите к шприцу тупую иглу 18-го калибра. После этого с помощью иглы нанесите эпоксидную смолу на наконечник. Полностью заполните наконечник эпоксидной смолой.

Вставьте волокно в наконечник так, чтобы он был заподлицо с нижней частью наконечника. При необходимости перед сушкой сотрите излишки эпоксидной смолы с полированной поверхности волокна влажной безворсовой салфеткой. На этом этапе подготавливайте микропривод башни перед каждым сеансом тестирования.

Затем прикрепите направляющую трубку 25 калибра со скошенным наконечником к нижнему зажиму на приводе. Закрепите большой объемный осветитель в верхнем зажиме на том же диске. Этот зажим крепится к приводному двигателю.

После этого полностью проденьте осветитель большого объема через направляющую трубку и убедитесь, что кончик осветителя выходит за кончик направляющей трубки. В качестве альтернативы, лабораторная лента может быть прикреплена к волокну таким образом, чтобы лента, а не само волокно, была зажата, чтобы защитить волокно. Далее замочите направляющую трубку и осветитель в антисептическом растворе для стерилизации.

Поместите изготовленную на заказ стерилизованную решетку с расстоянием в один миллиметр между отверстиями внутри чистой камеры и закрепите ее в заданном положении с помощью винта сбоку камеры. Втяните стерилизованный осветитель из направляющей трубки, потянув его вверх с помощью стерильных тупых щипцов. Наконечник осветителя должен находиться на 5-10 миллиметров выше кончика направляющей трубки.

Прикрепите микропривод к держателю и поместите направляющую трубку в отверстие целевой решетки. Затем опустите ступень микропривода до тех пор, пока направляющая трубка не пройдет прямо через уровень твердой мозговой оболочки. При этом опустите осветитель вручную с помощью стерильных щипцов.

Если есть какое-либо сопротивление, втяните осветитель на пять-10 миллиметров, подождите 10 минут и повторите попытку. Если при второй попытке сопротивление все еще есть, втяните наконечник осветителя в направляющую трубку, опустите направляющую трубку на 0,25 миллиметра и повторите попытку. Подключите наконечник на другом конце осветителя к более крупной оптической установке или лазеру.

На этом рисунке видно, что частота ошибок значительно увеличилась с освещением. Растровые графики здесь показывают торможение нейронов, охватывающих 2,5 миллиметровую толщину коры головного мозга. И потенциал локального поля, показывающий световой артефакт, охватывающий 4,5 миллиметра.

После освоения осветитель большого объема может быть изготовлен с использованием этой технологии за 10-15 минут, плюс время сушки эпоксидной смолы. Калибровка добавляет еще полчаса или около того, поэтому для максимальной эффективности мы обычно делаем несколько осветителей одновременно. При проведении этой процедуры важно помнить, что многие из осветителей не будут соответствовать стандартам контроля качества.

Порядок. Если они не проходят проверку наконечников, мы их выбрасываем. Но если они не проходят калибровку, мы обычно повторно полируем их и повторяем калибровку.

После своего развития этот метод помог исследователям в области нейробиологии использовать оптогенетику для подавления нейронного возбуждения и модуляции поведения у приматов. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как построить осветитель тканей большого объема.