Практические соображения в изучении метастатического легких колонизации в остеосаркома, используя Assay легочных метастазов

Общей целью данного анализа метастазов в легких является непосредственная визуализация и изучение роста клеток метастатической остеосаркомы в жизнеспособной легочной ткани. Этот метод может помочь ответить на действительно ключевые вопросы в области метастазирования остеосаркомы. Например, как клетки метастатической остеосаркомы адаптируются, выживают и размножаются в микросреде легких.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет напрямую визуализировать рост клеток метастатической остеосаркомы в соответствующей трехмерной микросреде. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности из-за технически сложных этапов канюляции трахеи и инсуффляции легкого. Инъекции опухолевых клеток в хвостовую вену и эвтаназия мышей проводятся в соответствии со стандартными институциональными рекомендациями.

Через пять минут поместите усыпленную мышь в положении лежа на спине на стерильную подушечку в капюшоне для ламинарного потока и с помощью небольших стерильных ножниц осторожно рассеките грудину за грудным входом с обеих сторон трахеи, не прокалывая легкие. Рассечение всех мышц и соединительной ткани, окружающих трахею, имеет важное значение для успешной канюляции. Затем используйте катетер 20 калибра для внутривенного введения, чтобы осторожно канюлировать трахею, и используйте стерильный кетгутовый шов, чтобы неплотно закрепить катетер и трахею.

Подсоедините набор для внутривенного вливания от катетера к 10-миллилитровому шприцу гравитационного аппарата и налейте в шприц жидкую агарозу с температурой 37 градусов Цельсия, смешанную с раствором среды. Наполните легкие раствором агарозы до полного их наполнения. Затем снимите канюлю и плотно завяжите шов, чтобы предотвратить вытекание раствора агарозы.

Важно сохранить легкое в целости и сохранности во время инсуффляции. Правильная инсуффляция агарозой и последующее охлаждение ощипывания, позволит поддерживать легкое в расширенном состоянии. Соберите материал для выщипывания, трахеи, сердца и легких, стараясь не проколоть или не повредить поверхность легкого.

Поместите ткани в 30 миллилитров предварительно охлажденного PBS с добавлением антибиотиков и дайте агарозе застыть. Положите ощипыватель на лед на 20 минут. Через 20 минут с помощью тонких ножниц и пинцета разрежьте легкое на 3 кусочка по 1,5 миллиметра и поместите ломтики в отдельные лунки 6-луночной пластины, содержащей 2 х 2 сантиметровые желатиновые губки, предварительно замоченные в среде В.

В день визуализации осторожно переложите срезы легких из 6-луночного планшета в стерильную круглую чашку со стеклянным дном диаметром 35 миллиметров, расположенную в столбцах в соответствии с их экспериментальной группой. Затем на широкопольном флуоресцентном микроскопе выберите объектив с 2,5-кратным увеличением и установите параметры визуализации, чтобы обеспечить наилучший контраст между флуоресцентными опухолевыми клетками и нефлуоресцентной фоновой тканью в контрольной группе образцов ткани. Визуализируйте все образцы с использованием тех же параметров, что и для контрольных тканей.

Если программное обеспечение не откалибровано по шкале, сделайте изображение микрометра с помощью того же объектива, что и легочная ткань, чтобы получить эталон масштаба, и сохраните все изображения в виде файлов TIF. Когда все изображения будут получены, для анализа изображений в ImageJ откройте первый файл. Используйте инструмент выделения многоугольника, чтобы обвести весь срез легкого, чтобы определить площадь всего среза легкого.

Выделите процесс и вычтите фон. Установите радиус катящегося шара на начальное значение 50 пикселей. Это значение будет зависеть от степени фоновой флуоресценции и должно быть оптимизировано для каждого набора данных.

Обязательно снимите галочку со светлого фона. Выберите изображение и тип, 8-битный, затем изображение и свойства, введите пиксели. В поле «Единица длины» введите 1 для ширины в пикселях, высоты в пикселях и глубины вокселя.

Затем отметьте глобальный флажок, чтобы применить эти параметры ко всем последующим изображениям. Далее выберите изображение, затем отрегулируйте, затем порог. Выделите стандартный и черно-белый цвета, а затем используйте ползунок для порогового значения изображения, чтобы большинство опухолевых клеток были точно выделены.

Нажмите «Применить» один раз, чтобы сделать легкое черным, а флуоресцентные поражения белыми. Затем нажмите «Применить» второй раз, чтобы инвертировать изображение так, чтобы все флуоресцентные структуры стали черными. Чтобы количественно оценить количество и форму поражений, выберите «Анализ и установка измерений», а также «Проверьте область».

Снимите все остальные галочки. Затем выберите «Анализировать частицы» и в поле «Размер» используйте область наименьшего поражения, определенного как одна клетка с помощью ImageJ, чтобы задать диапазон форм, которые будет перечислять программа. Используйте изображение из группы транспортных средств нулевого дня, чтобы выбрать наименьшую область, которая считается одной опухолевой клеткой.

Когда нижний предел будет установлен, нажмите OK. Появится окно результатов, содержащее все перечисленные формы и измерения площади. Затем скопируйте и вставьте данные из окна результатов в электронную таблицу и используйте математическую функцию суммирования, чтобы добавить все области метастатических поражений для этого конкретного среза легкого.

Метастатическая склонность к высоким и низким метастатическим клеточным линиям визуально проявляется в течение прогрессивных временных точек. В частности, эти микроскопические изображения показывают, как клетки с высоким уровнем метастатического образования способны колонизировать легкие более эффективно, чем клеточные линии с низким уровнем метастазирования. Анализ изображений, количественная оценка и статистический анализ данных изображений подтверждают, что высокометастатические опухолевые клетки могут эффективно колонизировать легочную ткань.

В то время как клетки с низким уровнем метастатического образования вообще не могут расти. Конфокальная флуоресцентная микроскопия с большим увеличением позволяет визуализировать клетки паренхимы легких в больших пространственных деталях по сравнению с опухолевыми клетками, экспрессирующими EGFP. А также облегчает анализ субклеточных структур, таких как настоящие митохондрии.

В зависимости от количества используемых мышей, эта техника может быть выполнена за четыре часа, если она выполнена правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о работе с чистым, стерильным хирургическим оборудованием. После своего развития этот метод проложил путь для исследователей в области исследования рака, чтобы изучить прогрессирование метастазирования в легких мышей.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как анализ клеточных культур in vitro и вестерн-блоттинг, чтобы ответить на дополнительные вопросы о влиянии нокдауна гена или медикаментозного лечения на раковые клетки. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить анализ на легочные метастазы. Не забывайте, что работа с раковыми клетками человека может быть чрезвычайно опасной, и что при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как работа в лаборатории биологического уровня безопасности.