Изготовления и проверки системы орган на чипе с интегрированной электроды непосредственно поддается трансэндотелиальной электрическое сопротивление

Общая цель этого видео — показать, как изготавливать и использовать микрофлюидные чипы со встроенными электродами для измерения трансэндотелиального или трансэпителиального электрического сопротивления или измерений TEER. Это продемонстрировано с помощью гематоэнцефалического барьера в микрофлюидном чипе. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области органов-на-чипах, позволяя напрямую измерять барьерную функцию, например, ткани гематоэнцефалического барьера с помощью встроенных электродов.

Основное преимущество нашей методики заключается в том, что электроды легко интегрируются в системы «орган-на-чипе» и что результаты этого могут быть сравнены между различными системами. Применение этой технологии распространяется на понимание функции гематоэнцефалического барьера в здоровье и болезнях, открытие лекарств и персонализированную медицину. Хотя этот метод может быть использован для получения представления о функции гематоэнцефалического барьера, он также может быть использован в контексте других систем Organ-on-Chip, таких как Lung-on-Chip и Gut-on-Chip.

Чтобы начать эту процедуру, тщательно перемешайте 27 граммов базового агента PDMS и 2,7 грамма отвердителя. Затем дегазируйте смесь в эксикаторе примерно на 45 минут, чтобы удалить пузырьки воздуха. Тем временем подготовьте форму для жидкой смеси PDMS, наклеив вокруг формы прозрачную ленту, или поместите форму в подходящий держатель для пластин

Вылейте дегазированную смесь PDMS на форму. Затем засушите смесь PDMS в духовке при температуре 60 градусов Цельсия в течение четырех часов и дайте ей остыть. В колпаке с поперечным потоком вытащите отвержденный PDMS из формы.

Разрежьте реплику PDMS на отдельные верхнюю и нижнюю части чипа с помощью линий разреза в PDMS. После этого проделайте четыре отверстия в верхних частях с помощью острого биопсийного перфоратора диаметром один миллиметр, чтобы сформировать входные и выходные отверстия. Пробивайте перфорацию изнутри наружу, чтобы предотвратить скопление мусора PDMS в микросхеме.

Затем накройте детали чипа прозрачной лентой, чтобы защитить их от пыли. Впоследствии вырежьте поликарбонатные мембраны из трансвелловых вставок на квадраты примерно три на три квадратных миллиметра. После этого соберите пористую мембрану без утечек между двумя частями PDMS, чтобы собрать двухслойное устройство, сопряженное с пористой мембраной.

Для этого приготовьте толуоловый раствор PDMS, используя 0,7 грамма базового агента PDMS, 07 граммов отвердителя и 540 микролитров толуола. Тщательно снесите раствор, затем нанесите 200 микролитров раствора на стеклянную покровную крышку при 1500 оборотах в минуту в течение 60 секунд, чтобы получить тонкий, равномерный слой раствора. Далее переложите тонкий слой раствора с покровного стекла на нижнюю часть скола с помощью чернильного валика.

Положите нижнюю часть в форму, пригодную для духовки, а затем переложите ступку на верхнюю часть чипса. С помощью набора пинцетов окуните края мембраны в мерку с покрытием и аккуратно поместите ее в середину нижней части. После этого аккуратно поместите верхнюю часть на нижнюю, уделяя при этом внимание выравниванию.

Заклейте входные отверстия чипсов прозрачной лентой, чтобы предотвратить попадание пыли внутрь чипсов, и запекайте их при температуре 60 градусов Цельсия в течение трех часов. На этом этапе очень важно быть осторожным. Не оказывайте давления на чип и не скользите верхней частью по нижней, чтобы предотвратить попадание раствора в каналы и засорение мембраны.

Чтобы встроить электроды в боковые каналы, разрежьте платиновую проволоку на куски длиной два сантиметра. Далее погрузите их в ацетон на 30 минут. Затем промойте их водой с этанолом и дайте им высохнуть.

В вытяжку с поперечным потоком положите скол на пластиковую посуду. Вставьте четыре платиновых провода в электродные каналы чипа с помощью пинцета и пригните их к пластиковой чашке, чтобы обеспечить фиксацию к чашке на следующем этапе. Вставьте проволоки от 0,7 до одного миллиметра в канал для культивирования за место соединения Т-образного канала.

Затем нанесите каплю УФ-отверждаемого клея на вход в канал электрода и позвольте клею заполнить канал за счет капиллярных сил. Затем включите ультрафиолетовое излучение и отверждите клей, когда он достигнет конца электродного канала. Закреплены четыре встроенных электрода на пластиковой тарелке с помощью двухкомпонентного эпоксидного клея.

После этого накройте чипсы прозрачным скотчем и запекайте их при температуре 60 градусов Цельсия в течение двух часов. Дайте им остыть и храните без пыли до использования. Чтобы покрыть чипы и способствовать прикреплению клеток, сначала заполните оба канала PBS перед введением реагентов.

Проверьте под микроскопом, нет ли в каналах пузырьков воздуха. Если это так, удалите их, промыв дополнительной PBS. Затем заполните оба канала 30 микролитрами 20 микрограммов на миллилитр человеческого фибронектина в PBS.

Инкубируйте их при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех часов. Затем промойте чипсы эндотелиальной питательной средой и инкубируйте их при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух часов. После этого измерьте TEER заготовки стружки, чтобы убедиться, что все электроды находятся в прямом контакте с жидкостью в каналах.

Для этого возьмите чип из инкубатора и дайте ему нагреться до комнатной температуры не менее десяти минут. Удалите жидкость из пластиковой чашки вокруг электродов, чтобы предотвратить образование электромостов за пределами микросхемы. Затем возьмем спектр импеданса от 200 герц до одного мегагерца для каждой комбинации из двух электродов, что приведет к шести спектрам импеданса на микросхему за пять-десять минут, из которых можно напрямую определить TEER.

Проверьте, имеют ли спектры импеданса ожидаемые величины и формы для валидации измерения TEER. Теперь приготовьте клеточную суспензию для установки в верхний канал, удалив питательную среду из колбы с культуральным колбой со сливающимся монослоем клеток hcMEC/D3. После этого промойте клетки с помощью PBS.

Удалите PBS, а затем добавьте два миллилитра 05% трипсина ЭДТА и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух-пяти минут, пока клетки не отделятся от колбы с культурой. Затем деактивируйте трипсин питательной средой с добавлением 20% FBS. Посчитайте ячейки и подсчитайте их общее количество в суспензии.

Тем временем центрифугируйте клетки hcMEC/D3 при 390 умноженных на g в течение пяти минут. После этого удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в соответствующем объеме эндотелиальной среды для роста, чтобы получить концентрацию в пять миллионов клеток на миллилитр, что соответствует плотности затравки в 200 тысяч клеток на квадратный сантиметр в чипе. Затем медленно нанесите пипетку 30 микролитров хорошо перемешанной клеточной суспензии в верхний канал и плавными движениями извлеките пипетку из входного отверстия, продолжая оказывать давление.

Проверьте плотность заделки семян под микроскопом. Должно быть достигнуто равномерное распределение ячеек по всему верхнему каналу. Затем инкубируйте чипсы при температуре 37 градусов Цельсия и пятипроцентном углекислом газе в течение как минимум одного часа.

После этого промойте все неприкрепленные клетки эндотелиальной питательной средой. Имейте в виду, что TEER контролируется в течение периода культивирования. Это типичный спектр схематического импеданса, показывающий величину импеданса и фазовый сдвиг в зависимости от частоты для спектроскопии электрического импеданса на чипах без ячеек и с ячейками.

Существует четыре основные области, в которых доминируют емкость двойного слоя на электродах, сопротивление питательной среды, сопротивление клеточного барьера или емкость клеточной мембраны. Область интереса указывает, где вклад клеточного слоя может быть количественно определен. Вот формула для расчета TEER на основе измеренных сопротивлений между всеми шестью комбинациями из четырех электродов.

Здесь показано среднее значение TEER в четыре BBB на чипах в течение трехдневного периода культивирования, достигая плато 22 плюс-минус 1,3 Ом квадратного сантиметра. Для сравнения приведены данные по заготовкам чипов, показывающие предельное изменение и отклонение от нулевого Ом квадратного сантиметра за тот же период по сравнению с изменением значения TEER чипов с ячейками. Флуоресцентная микрокопия окрашенных ядер выявила непрерывный монослой эндотелия как на ПДМС, так и на мембране в месте, указанном на врезке.

Иммунофлуоресценция выявила наличие белка узонов, окклюденс, что указывает на то, что специфичные для ГЭБ плотные соединения между клетками приводят к измеренному TEER. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о производстве и использовании чипов со встроенными электродами для измерений TEER в Organs-on-Chips. Этот метод может быть использован в области исследований гематоэнцефалического барьера для изучения прямой доставки и характеристик заболевания, например, при болезни Альцгеймера.

После этой процедуры барьерная функция эндотелия мозга, дифференцированного из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных от человека, также может быть отслежена для применения в персонализированной медицине.